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栗疫病菌凋亡抑制蛋白基因Cpbirl的功能研究

作　者: 高坤
导　师: 王克荣
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 栗疫病菌 IAPs ROS 致病性 Cpbir1
分类号: S436.64
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


细胞凋亡对于多细胞生物正常的生长发育、细胞分化和形态建成是必不可少的。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)家族除能够抑制细胞凋亡外,还参与了细胞分裂、重金属代谢、形态建成、信号途径的转导、免疫反应调节等过程,它在生命体中的作用既复杂又重要。以往对凋亡抑制蛋白的研究主要集中于病毒、哺乳动物、线虫、果蝇、酵母等模式生物,而在丝状真菌中未见敲除相关基因的报道。为此,本文着重研究了引起栗疫病的丝状真菌栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的凋亡抑制蛋白基因的功能。本研究利用生物信息学方法在C. parasitica中预测到了一个IAP蛋白的编码基因,命名为Cpbir1;该基因编码的蛋白包含两个BIR结构域,进化关系上与人类Survivin和酵母Birlp亲缘关系较近。Southern杂交结果显示该基因在栗疫病菌基因组中为单拷贝。通过定向基因敲除的方法对Cpbir1的功能进行了初步的探索。结果显示：果疫病菌Cpbir1突变体与野生型相比气生菌丝减少,色素沉积增加,生长速率变慢,生长一段时间后停止生长,菌丝膨大且分支增多,不产生分生孢子,致病力严重下降；在低菌龄的菌株中CpBir1定位在细胞核内,但在老龄的菌株中CpBir1同时定位在细胞核和细胞质内；实时荧光定量PCR分析表明,在弱毒力菌株中因弱毒力病毒的侵染造成Cpbir1转录下调；与野生型相比,Cpbir1敲除使菌株抗H2O2的能力明显下降,而CpBir1过表达使菌株更耐H2O2胁迫,且H2O2能够诱导野生型菌株CpBir1的上调表达；通过罗丹明123对菌丝染色显示突变体菌丝中活性氧含量显著升高；Cpbir1突变体耐Cu2+和Na+胁迫的能力下降；突变体漆酶活性没有下降,但多聚半乳糖醛酸酶活性明显下降；通过与突变体菌株相差一个vic基因的各菌株与突变体、野生型以及互补株的配对培养发现,Cpbir1的敲除影响了弱毒力病毒的传播：Cpbir1突变体接受病毒的能力与野生型相比下降,但Cpbir1突变的弱毒力菌株与非突变体弱毒力菌株相比传播病毒的能力没有下降。综上所述,笔者认为CpBir1参与了C.parasitica的细胞衰老、细胞凋亡和抗逆境过程,并且是栗疫病菌产孢和致病性的关键蛋白；栗疫病菌中的弱毒力病毒使Cpbir1转录下调；反之,该基因也能影响病毒的传播。

全文目录


摘要  6-7ABSTRACT  7-9上篇 文献综述  9-28  凋亡抑制蛋白(IAP)家族概述  10-20    1 细胞凋亡  10-11      1.1 细胞凋亡的定义  10      1.2 细胞凋亡的相关蛋白  10-11    2 IAP蛋白的发现  11    3 IAP蛋白的结构和分类  11-14      3.1 IAP蛋白的结构  11-13      3.2 IAP蛋白的分类  13-14    4 IAP蛋白的功能  14-17      4.1 IAP蛋白与细胞凋亡  14-15      4.2 IAP蛋白与细胞分裂  15-16      4.3 IAP蛋白的其它功能  16-17    5 IAP蛋白在真菌中的研究进展  17-18    6 栗疫病的生物防治及栗疫病菌IAP蛋白的研究意义  18-20      6.1 低毒力病毒防治栗疫病  18-19      6.2 栗疫病菌营养体不亲和性  19      6.3 栗疫病菌IAP蛋白的研究意义  19-20  参考文献  20-28下篇 研究内容  28-69  栗疫病菌凋亡抑制蛋白基因Cpbirl的功能研究  29-63    1 材料与方法  31-39      1.1 供试菌株及培养条件  31      1.2 栗疫病菌DNA、RNA提取和cDNA合成  31      1.3 栗疫病菌Cpbir1基因的克隆与蛋白序列分析  31-32      1.4 栗疫病菌Cpbir1敲除突变△Cpbir1的获得  32-35      1.5 △Cpbir1生长表型观测及产孢分析  35      1.6 △Cpbir1的致病性分析  35-36      1.7 菌丝内活性氧检测  36      1.8 Cpbir1转录水平测定  36      1.9 胞外漆酶及多聚半乳糖醛酸酶活性的检测  36-37      1.10 Cpbir1敲除对病毒传播的影响  37      1.11 突变体互补试验  37-38      1.12 CpBir1的亚细胞定位  38-39    2 结果与分析  39-59      2.1 Cpbir1生物信息学预测与分析  39-41      2.2 Cpbir1敲除载体pKG1的构建和敲除突变体的获得  41-43      2.3 △Cpbir1菌落形态异常,生长速度减慢,生物量积累变少  43-44      2.4 △Cpbir1菌丝形态异常  44-46      2.5 △Cpbir1丧失产孢能力  46      2.6 △Cpbir1致病性下降  46-48      2.7 Cpbir1与栗疫病菌抗H_2O_2相关,H_2O_2能诱导Cpbir1转录上调  48-50      2.8 △Cpbir1活性氧积累增加  50-51      2.9 △Cpbir1抗胁迫能力下降  51-52      2.10 △Cpbir1胞外漆酶活性没有下降,多聚半乳糖醛酸酶活性降低  52-53      2.11 Cpbir1敲除影响病毒传播  53-57      2.12 CpBir1定位于幼龄菌丝的细胞核,老龄菌丝中同时定位于细胞质  57-59      2.13 Cpbir1基因功能互补实验  59    3 讨论  59-63  参考文献  63-69附录  69-71攻读硕士学位期间发表的论文  71-73致谢  73

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 坚果类病虫害
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