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异种EGFR胞外区重组DNA疫苗与蛋白质疫苗的制备及抗小鼠肿瘤作用研究

作　者: 吴永
导　师: 张培德；谈立松
学　校: 复旦大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肿瘤表皮生长因子受体 DNA疫苗蛋白质疫苗 Fc融合蛋白分泌表达抗肿瘤主动免疫治疗
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是原癌基因c-erbB基因编码的170kDa跨膜糖蛋白,具有胞内酪氨酸激酶活性。由于在多种上皮恶性肿瘤中,EGFR都发生一定程度的突变或异常高表达,且与肿瘤患者的不良预后密切相关。因此,EGFR是一种肿瘤的标志性抗原,可将其作为肿瘤治疗的靶点之一。本研究首次将鸡源EGFR(cEGFR)胞外Ⅱ-Ⅲ区作为抗原,免疫球蛋白IgG-Fc片段作为疫苗载体分子与cEGFR片段融合,构建了重组DNA疫苗和蛋白质疫苗,评价这两种疫苗在小鼠Lewis肺癌模型中的抗肿瘤主动免疫疗效,探讨其抗肿瘤作用机制。我们用重叠延伸PCR法扩增获得cEGFR-Fc融合基因,克隆至pVAX1质粒构建重组DNA疫苗pVAX1-cEGFR-Fc,同时,构建载有溶葡球菌酶信号肽序列的pET-28a(+)-S公用分泌型大肠杆菌表达载体,将cEGFR-Fc融合基因克隆至该载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达的融合蛋白cEGFR-Fc经Protein A亲和层析纯化后作为蛋白疫苗。48只C57BL/6J小鼠随机平分为4组:单用DNA疫苗组、单用蛋白质疫苗组、DNA疫苗和蛋白疫苗联合免疫组及生理盐水对照组,各组小鼠免疫4次后接种Lewis肺癌细胞,观测肿瘤生长情况及小鼠生存状态及毒副反应。19天后脱颈椎处死小鼠,剥离肿瘤称重并计算抑瘤率。Western blot法检测小鼠血清中是否产生了抗EGFR抗体,ELISA法检测抗体滴度。分离免疫小鼠脾脏细胞,检测淋巴细胞对靶细胞A431的细胞毒性作用。本研究成功构建了重组质粒pVAX1-cEGFR-Fc和pET28a(+)-S-cEGFR-Fc,其中,pET28a(+)-S-cEGFR-Fc转化大肠杆菌后,经诱导表达在发酵上清液中获得了30～35%分泌蛋白,经Protein A亲和层析纯化,得到纯度达85%以上的重组融合蛋白。动物实验结果表明,三疫苗组小鼠肿瘤明显小于生理盐水对照组(P＜0.01),联合免疫组小鼠肿瘤亦明显小于DNA疫苗组、蛋白疫苗组(P＜0.01)。DNA疫苗组、蛋白质疫苗组和联合免疫组抑瘤率分别为37%、49%和63%。三疫苗组小鼠血清中均有抗EGFR抗体产生,其中联合免疫组抗体滴度最高,蛋白质疫苗组次之,DNA疫苗组最低。免疫后的小鼠脾脏细胞对EGFR受体高表达的A431细胞具有杀伤作用,效靶比为10:1时具有最大杀伤率。本研究证实,异种同源EGFR胞外Ⅱ-Ⅲ区重组DNA疫苗和蛋白质疫苗能打破机体对自身EGFR分子的免疫耐受,产生特异性免疫反应,对小鼠Lewis肺癌有明显的抑制作用。两种疫苗的联合使用可进一步加强抑瘤作用。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
第一章文献综述  9-19
  1.EGFR及其生物学功能  9-12
    1.1 EGFR的结构特征  9-10
    1.2 EGFR信号传导通路  10-12
  2.EGFR信号通路与肿瘤  12-15
    2.1 EGFR过度表达  13
    2.2 EGFR酪氨酸激酶区突变  13
    2.3 EGFR基因重排  13-14
    2.4 配体自分泌机制  14-15
  3.靶向EGFR肿瘤治疗进展  15-19
    3.1 小分子酪氨酸激酶抑制剂  15-16
    3.2 靶向EGFR单克隆抗体  16-17
    3.3 EGFR靶向主动免疫治疗  17-19
第二章异种EGFR胞外区重组DNA疫苗与蛋白质疫苗的构建  19-42
  1.实验材料  19-22
    1.1 菌株和质粒  19-20
    1.2 主要试剂  20
    1.3 培养基及主要溶液  20-22
      1.3.1 大肠杆菌操作相关试剂  20
      1.3.2 琼脂糖凝胶电泳相关试剂、缓冲液  20
      1.3.3 质粒大量制备相关试剂  20-21
      1.3.4 SDS-PAGE相关试剂、缓冲液  21
      1.3.5 WESTERN BOLT相关试剂、缓冲液  21
      1.3.6 PROTEIN A-SEPHAROSE FAST FLOW蛋白层析缓冲液  21
      1.3.7 其他溶液、缓冲液  21-22
    1.4 主要实验仪器  22
  2.实验方法  22-36
    2.1 鸡睾丸组织cDNA的获得  22-23
      2.1.1 鸡睾丸组织总RNA提取  22-23
      2.1.2 鸡睾丸组织总RNA反转录  23
    2.2 重叠延伸拼接PCR扩增cEGFR-Fc融合基因  23-25
    2.3 DNA疫苗质粒pVAX1-cEGFR-Fc的制备  25-30
      2.3.1 PCR产物的回收  25
      2.3.2 PCR产物TA克隆  25-26
      2.3.3 大肠杆菌DH5A感受态细胞的制备  26
      2.3.4 连接产物转化大肠杆菌DH5A感受态细胞  26
      2.3.5 大肠杆菌转化子的筛选与鉴定  26-27
      2.3.6 重组质粒DNA提取  27
      2.3.7 酶切鉴定质粒  27-28
      2.3.8 重组质粒PVAX1-cEGFR-Fc的构建  28-30
    2.4 pET-28A(+)-S-cEGFR-Fc表达载体的构建  30-32
    2.5 cEGFR-Fc重组蛋白的表达、鉴定及纯化  32-36
      2.5.1 cEGFR-Fc重组蛋白的诱导表达  32
      2.5.2 表达产物的SDS-PAGE分析  32-33
      2.5.3 免疫印记(WESTERN BLOT)法检测表达产物  33
      2.5.4 重组工程菌的发酵及发酵液预处理  33-35
      2.5.5 PROTEIN A-SEPHAROSE FAST FLOW亲和层析纯化目的蛋白  35
      2.5.6 蛋白浓度测定  35-36
  3.实验结果  36-40
    3.1 鸡睾丸组织总RNA提取  36
    3.2 重叠延伸拼接PCR扩增cEGFR-Fc融合基因  36
    3.3 测序鉴定  36-37
    3.4 重组质粒鉴定及序列分析  37-38
    3.5 表达产物SDS-PAGE分析  38-39
    3.6 表达产物WESTERN BLOT鉴定  39-40
    3.7 发酵液目的蛋白纯化和鉴定  40
  4.讨论  40-41
  5.小结  41-42
第三章 DNA疫苗和蛋白质疫苗抗小鼠肿瘤的作用研究  42-53
  1.实验材料  42-43
    1.1 动物和细胞系  42
    1.2 主要试剂  42-43
    1.3 主要溶液配制  43
    1.4 主要实验仪器  43
  2.实验方法  43-46
    2.1 细胞培养和收集  43
    2.2 DNA疫苗和蛋白质疫苗免疫动物  43-44
    2.3 小鼠LEWIS肺癌模型的建立  44
    2.4 肿瘤生长曲线的绘制并计算抑瘤率  44
    2.5 WESTERN BLOT法检测小鼠血清中抗EGFR抗体  44
    2.6 酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清抗EGFR抗体效价  44-45
    2.7 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的检测  45
    2.8 安全性观察  45-46
    2.9 统计学分析  46
  3.实验结果  46-50
    3.1 重组疫苗的抗肿瘤效果  46-48
      3.1.1 肿瘤体积的测量  46
      3.1.2 肿瘤重量和抑瘤率  46-48
    3.2 重组疫苗免疫诱导产生抗自身免疫反应  48-49
      3.2.1 WESTERN BLOT法检测小鼠血清中抗EGFR抗体  48-49
      3.2.2 ELISA法测定血清抗EGFR抗体效价  49
    3.3 CTL杀伤活性检测  49-50
    3.4 安全性观察  50
  4.讨论  50-52
  5.小结  52-53
参考文献  53-59
致谢  59-60
作者攻读研究生期间发表论文情况  60-61

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