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重组乙肝表面S抗原在CHO-K1细胞中的表达、克隆筛选

作　者: 邓军
导　师: 张宇锋
学　校: 天津大学
专　业: 药剂学
关键词: CHO细胞乙肝表面抗原 S蛋白稳定转染 PEI转染法磷酸钙转染法
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的全球性传染病。HBV除了引起急性肝炎外,还可导致慢性肝炎和肝硬化,而且与肝癌的发生有着密切的关系。曾在国内外广泛用于乙型肝炎预防的血源性乙肝疫苗(PDV)因血源供应有限和潜在危险性,己经逐步被基因工程疫苗所代替。中国仓鼠卵巢癌细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)经基因转染后分泌的重组乙肝表面S抗原,和乙肝病人血清来源的抗原同样具有系统的抗原活性,而且在灵长类动物的实验中发现CHO细胞重组乙肝抗原比血清抗原和酵母来源的抗原具有更高的免疫活性,表现为产生更多的抗体和更高的血清滴度。本课题主要内容是建立CHO-K1细胞基因转染乙肝表面S抗原基因的方法,并筛选出稳定表达的CHO细胞株。首先采用分子生物学的方法制备了转染级别的包含乙肝表面S抗原基因的两种质粒pS-1和pcDNA-s-1。然后,用两种转染方法分别转染COS-1细胞和CHO-K1细胞,并用ELISA的方法对转染结果进行检测。经过实验得知,磷酸钙转染法本身受其它很多因素影响且很大,转染方法不稳定;PEI转染法可以有效的转染细胞,实验稳定结果较好,并且确定了最佳的PEI/DNA的质量比为6.7。本实验还对PEI的毒性进行了测定,发现它对CHO-K1细胞毒性不大,细胞存活最少的也有76.01%存活。最后,确定了G418的最佳筛选浓度为600ug/ml后,用PEI转染法转染CHO-K1细胞,经G418加压筛选后,用酶联和透射电镜检测均得到细胞可稳定表达乙肝表面抗原的结论。在本课题中,成功的构建了稳定表达乙肝表面S抗原的CHO细胞株6H3。

全文目录

中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
第一章文献综述  7-21
  1.1 乙型肝炎简介  7-8
  1.2 乙型肝炎病毒  8-10
    1.2.1 HBV研究进展历程  8
    1.2.2 乙型肝炎病毒  8-10
  1.3 乙型肝炎疫苗  10-13
    1.3.1 乙型肝炎疫苗的发展  10-11
    1.3.2 新型乙肝疫苗  11-13
  1.4 基因工程药物表达系统  13-16
    1.4.1 原核表达系统  13-14
    1.4.2 真核表达系统  14-16
  1.5 基因转移系统  16-21
    1.5.1 病毒载体转移体系  17
    1.5.2 非病毒转移体系  17-21
第二章材料和方法  21-34
  2.1 实验材料  21-25
    2.1.1 细胞和菌株  21
    2.1.2 分子生物学常用溶液  21-22
    2.1.3 细胞培养常用溶液及相关试剂溶液  22-23
    2.1.4 主要生化试剂  23-24
    2.1.5 主要实验仪器  24-25
  2.2 实验方法  25-34
    2.2.1 SDS碱裂解法小量制备质粒实验  25
    2.2.2 大提质粒实验  25
    2.2.3 细胞培养实验  25-27
    2.2.4 HBsAg pAb（IgG）的生物素化  27-28
    2.2.5 表达上清中HBsAg ELISA检测实验  28
    2.2.6 磷酸钙介导的基因转染实验  28-29
    2.2.7 PEI介导的基因转染预实验（24 孔板）  29-30
    2.2.8 PEI介导的基因转染实验（6 孔板）  30-31
    2.2.9 MTT法检测细胞存活率实验  31
    2.2.10 PEI对CHO-K1 细胞毒性测定实验  31-32
    2.2.11 G418 筛选预实验－确定最佳筛选浓度实验  32
    2.2.12 基因转染后的 CHO-K1-S1 高表达筛选实验  32-34
第三章实验结果和讨论  34-62
  3.1 质粒的提取  34-37
    3.1.1 pS-1 质粒的提取  34-35
    3.1.2 pcDNA-S-1 质粒的提取  35-37
  3.2 细胞培养  37-38
    3.2.1 COS-1 细胞的培养  37
    3.2.2 CHO-K1 细胞的培养  37-38
  3.3 HBsAg pAb（IgG）的生物素化  38-39
  3.4 质粒转染细胞预实验  39-47
    3.4.1 磷酸钙介导的基因转染  39-44
    3.4.2 PEI介导的基因转染  44-47
  3.5 PEI对CHO-K1 细胞毒性测定  47-51
    3.5.1 PEI对CHO-K1 细胞毒性测定实验一  48-49
    3.5.2 PEI对CHO-K1 细胞毒性测定实验二  49-50
    3.5.3 PEI对CHO-K1 细胞毒性测定实验三  50-51
  3.6 G418 筛选预实验－确定抗生素最佳筛选浓度  51-53
  3.7 PEI/pcDNA-S-1 转染CHO-K1 细胞及高表达克隆细胞筛选  53-62
    3.7.1 转染细胞上清的ELISA检测  53-55
    3.7.2 筛选细胞的扩大培养  55-56
    3.7.3 稳定表达的ELISA检测  56-60
    3.7.4 透射电子显微镜检测  60-62
第四章实验总结  62-64
参考文献  64-67
发表论文和科研情况说明  67-68
致谢  68-69
附录  69-70

重组乙肝表面S抗原在CHO-K1细胞中的表达、克隆筛选

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