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应用增强型绿色荧光蛋白标记猪链球菌2型及实时定量PCR分析其体内感染动态

作　者: 李兆龙
导　师: 姚火春
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌2型增强型荧光蛋白基因同源重组 Egfp-HA9801重组菌实时定量PCR
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

猪链球菌2型（Streptococcus suis 2,SS2）可以导致猪脑膜炎、关节炎、败血症、浆膜炎、心内膜炎、多发性关节炎等,该病已成为严重影响各国养猪业发展的一种重要疫病,尤其在高密度的养猪场危害更大。同时对从业人员也带来严重的威胁,可以导致人的脑膜炎、心内膜炎及中毒性休克综合症等严重疾患。目前国内外对SS2的研究主要集中在SS2毒力相关因子上,目前公认的毒力相关因子有溶菌酶释放蛋白（muramidase released protein,MRP）、胞外蛋白因子（extrac-cellular factor protein,EF）、溶血素（suilysin,sly）、荚膜多糖（capsular polysaccharide,CPS）、orf2毒力基因（Encodingprotein by orf2,Orf2）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseGAPDH）、谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase,GDH）等。但是对于SS2如何突破黏膜屏障后进入血流传播,如何突破脑屏障进入脑部等尚不明了。本试验以增强型绿色荧光蛋白基因（Egfp）为报告基因,通过同源重组,构建带有绿色荧光蛋白标记基因的SS2重组菌（Egfp-HA9801）,应用实时定量PCR技术研究其在宿主体内的移行机制,以期阐明SS2的感染机制。1.重组质粒pESEB的构建以溶血素基因（sly）为同源臂的左端,继溶血素后的1165bp的（bsly）碱基为同源臂的右端,在两同源臂的中间加上外源基因Egfp和抗性筛选基因壮观霉素片段（spr）,将四个片段分别按序连接到自杀质粒pEVP3,经PCR扩增、酶切鉴定证明在自杀质粒pEVP3中插入的4个目的基因连接正确,成功构建了带有sly-Egfp-spr-bsly因的重组质粒pESBE,将该重组质粒转化到E.coli TOP-10中,获得高拷贝的增殖,用质粒大提试剂盒提取高纯度的重组质粒pESEB,浓度达1.5mg/mL。2. Egfp-HA9801重组菌的构建用含40 mmol/DL苏氨酸的新鲜THB培养基将SS2HA9801培养到细胞浓度为OD₆₀₀≈0.4后,立即用冰预冷的无菌双蒸水和0.3mol/L蔗糖溶液反复洗涤后保存在含0.3mol/L蔗糖的15%甘油溶液。经优化电转化的适宜条件为:10¹⁰CFU/mL感受态细胞80μL、1.5mg/mL的pESEB重组质粒质5μL、电阻250Ω、电压2.3kv、电流25μA。电转结束后用37℃预热的THY培养基培养2h,然后将菌液涂布于含有壮观霉素的THB平板,挑取壮观霉素筛选阳性克隆。经PCR和RT-PCR鉴定,证实Egfp基因已经按试验设计准确地插入到SS2 HA9801染色体中,成功地获得Egfp-HA9801重组菌,经鉴定所构建的重组菌在形态、培养、生化和动物致病力等方面没有发生本质性变化。3.实时定量PCR分析SS2 HA 9801在体内的感染动态在Egfp中选取142bp的保守片段作为目标基因,设计taqman探针及引物。将该保守片段连接到pMD-19质粒,构建一个双链环状标准品pMDE,通过实时定量PCR标准曲线,优化实时定量PCR条件。将Egfp-HA9801重组菌和THB培养基按口服和腹腔注射两种途径攻毒,在攻毒后8h后,各组处死1只小鼠/1h,取血、心、肝和脑组织,用煮沸法提取DNA模板,根据优化的条件,进行定量PCR检测,通过标准曲线测算各样本的起始拷贝数。检测结果为:腹腔注射组血液、心脏的DNA平均拷贝数为6.37×10⁸和5.64×10⁷,明显高于脑和肝脏中的（1.22×10⁶和1.87×10⁷）DNA平均拷贝数,两者差异显著（p<0.05）;口服组脑和血液中的DNA拷贝数为2.29×10⁸和6.71×10⁸明显高于高于心脏和肝脏的（2.36×10⁷和1.27×10⁶）DNA平均拷贝数,两者差异显著（p<0.05）。结果表明不同的接种途径SS2在动物体内的移行途径存在差异。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一篇文献综述  10-37
  第一章猪链球菌病及致病机理研究进展  10-23
    参考文献  18-23
  第二章荧光蛋白基因的简述  23-28
    参考文献  27-28
  第三章实时定量PCR原理及应用  28-37
    参考文献  36-37
第二篇研究内容  37-74
  第一章 PESEB重组质粒的构建  37-49
    摘要  37
    1 材料与方法  37-44
    2 结果  44-46
    3 讨论  46-47
    参考文献  47-49
  第二章　Egfp-HA9801重组株的获得及鉴定  49-61
    摘要  49
    1 材料与方法  49-55
    2 结果  55-57
    3 讨论  57-59
    参考文献  59-61
  第三章实时定量PCR  61-74
    摘要  61
    1 材料与方法  61-65
    2 结果  65-71
    3 讨论  71-73
    参考文献  73-74
全文总结  74-76
致谢  76

应用增强型绿色荧光蛋白标记猪链球菌2型及实时定量PCR分析其体内感染动态

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