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基于双基因载体系统的拟南芥维生素C合成代谢调控研究

作　者: 周寅
导　师: 唐克轩
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: 拟南芥维生素C 代谢工程转基因过量表达共转化实时定量PCR 限速酶
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

维生素C,又称抗坏血酸(L-Ascorbate acid,AsA)是植物体内主要的抗氧化物质,参与植物的光合作用和光保护,调控着植物的开花、结实、细胞凋亡、细胞壁代谢、细胞膨大和细胞分裂。人类失去了自主合成AsA的能力,必须从植物中不断获取。通过基因工程技术提高植物AsA含量,改良植物营养品质和抗性是分子育种新的发展方向之一。随着AsA的代谢工程研究的逐渐开展,AsA合成代谢的全部基因已经阐明,系统评价也已完成。本研究通过PCR从拟南芥cDNA中获得AsA合成代谢途径6个催化酶的编码基因,组合成4个双基因载体,在模式植物拟南芥中过表达,比较双基因转化和单基因转化对AsA含量的贡献。同时,也为选择最佳的多基因转化组合提供一些思路。过表达双基因和单基因转基因系,经实时定量PCR分析,目的基因表达量多数都有上调。AsA含量的HPLC分析结果显示,野生型(WT)和转空白质粒植株对照(CK)中AsA含量为35.83±8.64 mg/100g FW和34.84±11.45 mg/100g FW;各GGT-GLDH转基因株系中AsA含量最高为142.53±41.46 mg/100g FW,是相应对照的4.09倍；各GGT转基因对照株系中AsA含量最高126.39±22.53 mg/100g FW,是相应对照的3.63倍；各GLDH转基因对照株系中AsA含量最高61.51±5.03 mg/100g FW,是相应对照的1.77倍；双基因转化株系较单基因转化株系表现略好,但差异并不明显。各GMP-GME转基因株系中AsA含量最高的为44.92±27.17 mg/100g FW,是相应对照的1.29倍；各GGT-GPP转基因株系中AsA含量最高达到142.46±8.80 mg/100g FW,是相应对照的4.09倍；各GDH-GLDH转基因株系中AsA含量最高达到43.10±7.80 mg/100g FW,是相应对照的1.21倍。通过AsA含量的对比和各基因表达量的分析,高AsA含量的株系均有较高的GGT表达,进一步证实了GGT在L-半乳糖途径中是唯一的限速酶,其他基因效果则均不明显。这亦是双基因转化效果不明显的原因。GGT的表达还对其他基因有一定的拉动作用。本研究首次在同一种植物中比较了单基因转化和双基因转化的优缺点,揭示了双基因转化的规律,进一步提示了共转化选取最佳基因组合的一些思路,为制定和优化提高植物AsA含量的遗传工程改造策略提供了初步的实验依据。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-8
缩写词表  8-9
第一章文献综述植物中维生素C的功能、合成及代谢工程研究进展  9-21
  1 AsA在植物体内的生理功能  9-11
    1.1 植物抗氧化系统  9-10
    1.2 光合作用和光保护  10
    1.3 参与其它物质的合成  10
    1.4 细胞壁代谢、细胞膨大和细胞分裂  10-11
  2 植物中AsA的生物合成途径  11-17
    2.1 植物AsA的生物合成途径的阐明  11-14
    2.2 编码植物AsA合成途径中各反应催化酶基因的克隆和功能研究  14-17
      2.2.1 GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)  14
      2.2.2 GDP-D-甘露醇-3.5-差向异构酶(GME)  14-15
      2.2.3 GDP-L-半乳糖鸟苷酰转移酶(GGT)  15
      2.2.4 L-半乳糖-1-P-磷酸化酶(GGP)  15
      2.2.5 L-半乳糖脱氢酶(GDH)  15-16
      2.2.6 L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)  16-17
  3 植物中AsA的分解还原途径  17
  4 植物AsA代谢的生物工程  17-20
  5 展望  20-21
第二章材料与方法  21-33
  1 材料  21-23
    1.1 植物材料  21
    1.2 菌株和质粒  21
    1.3 酶与试剂盒  21
    1.4 细菌和植物培养基  21-22
      1.4.1 大肠杆菌培养基  22
      1.4.2 农杆菌培养基  22
      1.4.3 植物组织培养基  22
    1.5 抗生素配制  22
    1.6 引物合成与测序  22-23
  2 实验方法  23-33
    2.1 编码拟南芥AsA合成途径中酶的基因的获得  23-24
      2.1.1 拟南芥叶片总RNA提取  23
      2.1.2 拟南芥叶片总RNA反转录为cDNA  23
      2.1.3 使用KOD Plus进行PCR获得目的基因  23-24
      2.1.4 片段尾端加A  24
    2.2 载体构建方法  24-26
      2.2.1 质粒抽提  24
      2.2.2 酶切  24-25
      2.2.3 连接  25
      2.2.4 大肠杆菌感受态制备  25
      2.2.5 大肠杆菌转化  25
      2.2.6 检测阳性转化子  25-26
    2.3 农杆菌培养与转化  26
      2.3.1 农杆菌培养  26
      2.3.2 农杆菌转化  26
    2.4 拟南芥的培养与转化  26-28
      2.4.1 拟南芥的播种与培养  26-27
      2.4.2 拟南芥转化  27-28
    2.5 转基因拟南芥的分子检测  28-31
      2.5.1 转基因拟南芥DNA的抽提  28
      2.5.2 转基因拟南芥基因组DNA的PCR分析  28
      2.5.3 拟南芥组织总RNA小量抽提  28-29
      2.5.4 反转录  29
      2.5.5 实时定量PCR  29-31
    2.6 HPLC检测维生素C含量  31-33
      2.6.1 样品处理  31
      2.6.2 高效液相(HPLC)条件  31
      2.6.3 绘制标准曲线  31-32
      2.6.4 测定样品AsA含量  32-33
第三章拟南芥合成途径双基因转化  33-46
  1 拟南芥AsA合成途径基因的克隆和单基因载体构建  33-37
    1.1 基因特异引物的设计  33
    1.2 基因编码区的克隆  33-35
    1.3 基因点突变  35-37
    1.4 植物单基因表达载体的构建  37
  2 植物双基因表达载体的构建  37-39
    2.1 基因表达框引物的设计  37-38
    2.2 基因编码区的克隆  38
    2.3 植物双基因表达载体的构建  38-39
  3 拟南芥的转化和阳性植株的获得  39-40
    3.1 农杆菌的转化  39
    3.2 拟南芥的转化和筛选  39
    3.3 拟南芥的分子鉴定  39-40
  4 转基因拟南芥中基因表达量的分析  40-44
    4.1 实时定量PCR的引物设计  40-42
    4.2 编码AsA生物合成途径中各酶的基因的总表达量的分析  42-44
  5 HPLC测定转基因拟南芥AsA含量  44-46
第四章讨论与展望  46-49
  1 研究总结  46-48
  2 研究创新点  48
  3 后续的研究方向  48-49
参考文献  49-55
附录  55-57
  Ⅰ 载体图谱  55-56
  Ⅱ 实验中用到的主要仪器  56-57
硕士期间发表论文情况  57-58
致谢  58-59

基于双基因载体系统的拟南芥维生素C合成代谢调控研究

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