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BCB筛选和玻璃化冷冻前后绵羊卵母细胞中母源基因表达的差异性分析

作　者: 王静
导　师: 石庆华；黄俊成
学　校: 新疆农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 卵母细胞母源基因实时定量PCR 亮甲酚蓝染色液玻璃化冷冻
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

玻璃化冷冻对卵母细胞的发育潜能造成一定影响,而母源基因的表达不仅影响卵母细胞的生长,又对胚胎的早期发育起决定性作用。本实验通过玻璃化冷冻、BCB染色等方法,运用Real-time PCR技术检测的mRNA在卵母细胞中的表达量,探讨玻璃化冷冻前后的卵母细胞中母源基因的表达水平、BCB鉴定卵母细胞质量的可靠性与分子机理及Gdf9、Mater、Zar1、Dnmt1基因与玻璃化冷冻后卵母细胞质量的相关性。主要研究结果如下：经过BCB染色筛选后,胞质着色的为BCB+的卵母细胞体外成熟率、受精率及囊胚率依次为86.16%、85.29%、34.4%高于胞质未着色的BCB-50.94%、36.19%、6.73%(P<0.01)。这说明BCB对绵羊卵母细胞筛选这一方法的可行性和可靠性。这四种母源基因在BCB+卵母细胞中的表达量要显著低于BCB-(P<0.05),表明这四种母源基因的mRNA表达量可能与卵母细胞的质量呈负相关。对不同成熟时期的卵母细胞经玻璃化冷冻解冻后,继续进行体外培养。研究结果发现,GV期冷冻的卵母细胞的存活率、成熟率和卵裂率分别为45.93%、14.51%、9.67%,极显著低于对照组M24(—、91.11%、82.96%)、实验组M18h+V(68.29%、36.71%、23.21%)和实验组M24h+V(72.44%、48.91%、31.57%)(P<0.01),但M18h与M24h的冷冻效果差异不显著(P>0.05)。而卵母细胞中的母源基因表达量在GV+V最高(P<0.01)；GV期的卵母细胞母源基因的含量低于GV+V,但是高于其他实验组(P<0.01)；而M18h+V的母源基因表达量高于M24h+V(P<0.01)；V+M24h比M24h+V的卵母细胞母源基因含量高(P<0.01)；对照组(M24h未冷冻)的卵母细胞母源基因相对含量最低。这说明越接近成熟24h的绵羊卵母细胞其玻璃化冷冻保存的效果越好,而Gdf9、Mater、Zar1、Dnmt1基因的mRNA表达量与玻璃化冷冻有相关性,可能与卵母细胞质量、体外培养效率呈负相关性。分别将筛选的BCB+卵母细胞体外成熟24h再冷冻解冻(BCB(+)M24h+V),未筛选的卵母细胞体外成熟24h再冷冻解冻(M24h+V),进行体外培养,结果表明：实验组BCB(+)M24h+V的存活率、成熟率、卵裂率为87.85%、64.22%、48.78%,显著高于实验组M24h+V 72.44%、48.91%、31.57%(P<0.05)。实验组BCB(+)M24h+V的母源基因表达量要显著低于实验组M24h+V(P<0.05)。说明BCB染色可应用在玻璃化冷冻技术上,在卵母细胞冷冻前,可先筛选出质量好的卵母细胞,直接淘汰胞质不成熟的卵母细胞,从而减轻冷冻的工作量,提高了解冻后卵母细胞的可用率及胚胎的发育率,此方法可以考虑在今后生产中推广‘应用。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章引言  8-18
  1.1 研究目的与意义  8-9
  1.2 卵母细胞母源基因及研究进展  9-13
  1.3 玻璃化冷冻及研究进展  13-15
  1.4 卵母细胞质量评价  15-18
第2章 BCB筛选的阳性和阴性绵羊卵母细胞中母源基因Gdf9,Mater,Zar1,Dnmt1 mRNA的差异性表达  18-41
  2.1 实验材料与设备  18-21
  2.2 实验方法  21-28
  2.3 结果与分析  28-39
  2.4 讨论  39-41
第3章玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞母源基因Gdf9,Mater,Zar1,Dnmt1 mRNA表达量的影响  41-52
  3.1 实验材料与设备  41-42
  3.2 实验方法  42-43
  3.3 结果与分析  43-48
  3.4 讨论  48-52
第4章 BCB染色筛选出的阳性卵母细胞与未筛选的卵母细胞玻璃化冷冻后母源基因Gdf9,Zar1,Mater,Dnmt1 mRNA表达的差异性  52-58
  4.1 实验材料与设备  52
  4.2 实验方法  52
  4.3 结果与分析  52-56
  4.4 讨论  56-58
第5章结论  58-59
参考文献  59-67
致谢  67-68
作者简介  68-69

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