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家蚕耐氟近等基因系差异表达基因的研究

作　者: 王小强
导　师: 徐安英
学　校: 江苏科技大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 家蚕耐氟近等基因系抑制消减杂交双向凝胶电泳实时定量PCR
分类号: S882.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

我国是世界蚕业的发源地,栽桑养蚕、缫丝织绸已有5000多年的历史。栽桑养蚕是中国农业的一个重要组成部分,在国民经济中,已形成了一个农工贸完整的丝绸产业体系。蚕丝的出口贸易在我国国民经济中占有重要地位。蚕桑业的稳定发展对我国经济的发展具有深远的影响。家蚕氟化物耐受性是很重要的一项经济性状。在蚕业生产中,家蚕是寡食性昆虫,以桑叶作为食物来源。桑叶受到氟化物的污染后造成家蚕大量死亡,对蚕桑业造成严重的危害。因此,研究家蚕的中毒机理,筛选研究家蚕耐氟基因,培育家蚕耐氟品种,并对耐氟主效基因进行定位克隆,十分重要。本研究采用家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种733新构建耐氟近等基因系。以构建好的近等基因系为材料,解剖获取回交11代的家蚕耐氟近等基因系群体中的耐氟个体和敏感个体中肠,构建家蚕耐氟近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。通过对抑制消减杂交cDNA文库中随机挑选的153个阳性克隆测序和聚类拼接,得到19个叠联群(contig)、48个已知功能基因(unigene)和28个未知功能基因。获得的表达序列标签(EST)经Blast比对和同源性分析,初步发现这些基因参与家蚕体内物质转运、能量代谢、基因转录、蛋白质合成与降解、蛋白质加工、信号转导、机体免疫防御、细胞结构形成等诸多生物学过程。采用实时定量RT-PCR方法,对部分基因在家蚕耐氟近等基因系群体中的耐氟个体和敏感个体的不同组织的表达进行定量分析。结果发现,磷酸根离子转运蛋白基因、ATP合成酶基因、液胞型H+-ATP酶基因以及主要过敏原蛋白基因在中肠、马氏管、脂肪体中的相对表达量有较明显的上调。实验结果可为进一步阐明家蚕耐氟的分子机制打下基础。通过蛋白双向凝胶电泳及质谱技术,对家蚕耐氟近等基因系蛋白水平上的表达差异进行分析,最终得到了5个质谱鉴定结果可信的差异蛋白点,其中有2个蛋白点与家蚕的能量代谢和免疫防御有关,研究结果为今后展开蛋白功能方面的深入研究提供了一定基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第1章绪论  13-27
  1.1 家蚕耐氟性的研究现状  13-17
    1.1.1 氟化物对桑的污染  13-14
    1.1.2 氟化物对家蚕的影响  14-15
    1.1.3 家蚕耐氟性的遗传学研究现状  15-16
    1.1.4 家蚕耐氟品种的培育  16-17
    1.1.5 家蚕耐氟基因定位的研究进展  17
  1.2 抑制消减杂交技术（SSH）及其应用  17-21
    1.2.1 抑制性消减杂交技术的基本原理  17-18
    1.2.2 抑制性消减杂交技术的主要流程  18-19
    1.2.3 抑制性消减杂交技术的主要优缺点  19-20
    1.2.4 抑制性消减杂交技术的应用  20-21
  1.3 蛋白双向凝胶电泳技术（2-DE）及其应用  21-25
    1.3.1 蛋白双向凝胶电泳原理  22
    1.3.2 蛋白双向凝胶的基本流程  22-24
    1.3.3 蛋白双向凝胶电泳的应用  24-25
  1.4 本课题研究的框架体系  25-27
    1.4.1 本课题研究的主要内容和意义  25-26
    1.4.2 本课题研究的主要技术路线  26-27
第2章家蚕耐氟近等基因系SSH 文库的构建及其序列分析  27-54
  2.1 主要实验材料  27-29
    2.1.1 实验材料的准备  27
    2.1.2 主要实验仪器设备  27
    2.1.3 宿主菌、载体、酶和试剂  27-28
    2.1.4 常用试剂和缓冲液的配制  28-29
  2.2 实验方法  29-38
    2.2.1 家蚕中肠RNA 的提取  29
    2.2.2 mRNA 的分离纯化  29-30
    2.2.3 抑制性消减杂交  30-35
    2.2.4 消减cDNA 文库的构建  35-37
    2.2.5 消减cDNA 文库中差异表达基因的实时定量PCR 分析  37-38
  2.3 结果与分析  38-51
    2.3.1 总RNA 质量检测  38-39
    2.3.2 消减杂交产物的PCR 扩增  39-40
    2.3.3 消减cDNA 文库的构建和插入片段的PCR 鉴定  40
    2.3.4 消减cDNA 文库部分阳性克隆序列的同源性分析  40-47
    2.3.5 差异表达基因的Real-Time PCR 分析  47-51
  2.4 讨论  51-52
    2.4.1 家蚕耐氟近等基因系消减cDNA 文库的构建  51
    2.4.2 差异表达基因的实时定量PCR 分析  51-52
  2.5 本章小结  52-54
第3章家蚕耐氟近等基因系蛋白质组学差异分析  54-64
  3.1 主要实验材料  54-57
    3.1.1 实验材料准备  54
    3.1.2 主要实验仪器设备  54
    3.1.3 主要实验试剂配制  54-57
  3.2 主要实验方法  57-60
    3.2.1 家蚕中肠蛋白的提取  57
    3.2.2 Bradford 法测定样品蛋白浓度  57
    3.2.3 蛋白双向凝胶电泳  57-59
    3.2.4 双向电泳凝胶的图象扫描与软件分析  59-60
    3.2.5 差异蛋白点的质谱鉴定  60
  3.3 结果与分析  60-62
    3.3.1 中肠组织蛋白电泳图谱分析  60-61
    3.3.2 差异蛋白点的质谱分析结果  61-62
  3.4 讨论  62-63
  3.5 本章小结  63-64
结论  64-66
参考文献  66-72
附录1 本文所用的缩写语  72-73
攻读硕士学位期间发表的论文  73-74
致谢  74-76
大摘要  76-80

家蚕耐氟近等基因系差异表达基因的研究

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