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组蛋白修饰对pre-mRNA选择性剪接影响的分子机制研究

作　者: 万东方
导　师: 郭大玮
学　校: 山西医科大学
专　业: 法医学
关键词: 组蛋白修饰 DYN-2基因选择性剪接实时定量PCR
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的建立酿酒酵母中DYN-2基因选择性剪接的质粒模型,并用SYBR荧光染料实时定量PCR的方法来检测DYN-2基因第二外显子的相对表达含量,研究组蛋白的修饰对pre-mRNA选择性剪接的影响。方法在我们之前的工作中,得到了含有DYN-2基因的大肠杆菌质粒DNA。然后测序检测DYN-2片段是否正确导入,测序结果显示无误后用乙酸锂法将质粒DNA转入到不含质粒DNA的空白酵母中,于省却Trp的培养基中筛选出阳性克隆,标记为X酵母。我们进一步检测了未突变的组蛋白质粒DNA,以及含有H3K14A,H3K18A/H4K5A和H4K8A突变DNA,酶切检测所提质粒是否正确,结果无误后将突变的质粒DNA和未突变的质粒DNA分别转入到X酵母中,于省却Trp和Leu培养基中筛选出阳性克隆,并相应标记为O酵母、AA酵母、L酵母和Q酵母。然后提取O、AA、L、和Q酵母的总RNA,经DNase I处理后去除DNA污染,再逆转录为cDNA,-20℃或-80℃保存。设计并合成特异性反映DYN-2基因中第二外显子保留情况的引物,以及作为内参的SCR-1基因引物,使用SYBR荧光染料实时定量PCR检测各种突变情况下DYN-2基因第二外显子的相对表达水平。结果本文建立了组蛋白修饰对pre-mRNA选择性剪接影响的体外研究模型,使用酵母双杂交系统将模型基因和组蛋白突变基因导入同一酵母细胞内,并用RT-real time PCR方法检测不同的突变对模型质粒上DYN-2基因的剪接影响。以SYBR荧光染色法能够反映小基因DYN-2小基因模型第二外显保留/切除的相对表达水平,实验结果显示各组蛋白突变组相对于未突变组,第二外显子保留/切除的量均有下降。结论体外构建的组蛋白修饰对选择性剪接的影响模型,可更为直接有效的反映组蛋白修饰的变化对选择性剪接的影响;实时定量PCR对目的基因选择性剪接状况的测定准确,可作为选择性剪接研究的实用方法;组蛋白上赖氨酸的突变可能会对DYN-2基因的选择性剪接产生影响,但其相关性有待于进一步实验确证。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-7
英文缩写及含意  7-8
缩写名词附表  8-9
第一章前言  9-10
第二章材料与方法  10-26
  1. 材料  10-15
  2. 方法  15-26
第三章结果  26-35
  1. 模型质粒 DNA 的检测结果  26-27
  2. 酿酒酵母的高效转化  27-28
  3. 突变质粒 DNA 的检测及转化结果  28-30
  4. 酵母总 RNA 的提取  30-31
  5. RT-PCR 的琼脂糖凝胶电泳结果  31-32
  6. SYBR 荧光染料 Real –time PCR 的结果  32-35
第四章分析讨论  35-38
  1. 选择性剪接研究模型基因的选择  35
  2. pre-mRNA 选择性剪接的体外检测方法  35-36
  3. 本实验中所使用的检测方法  36-37
  4. 实验结果分析  37-38
第五章小结  38-39
参考文献  39-42
综述  42-48
  参考文献  46-48
个人简历  48

组蛋白修饰对pre-mRNA选择性剪接影响的分子机制研究

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