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猪精液5mL大管冷冻保存方法的建立及优化

作　者: 殷方芝
导　师: 张德福；徐银学
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪精液 5mL大管冷冻
分类号: S828.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

采用手握法采集成年上海白猪精液,收集中段富含精子部分,配制不同的稀释液,在不同条件下进行冻前预处理,并采用不同的冷冻高度进行冷冻,再用不同的解冻方法进行解冻,然后进行体外授精和人工授精试验;同时,还对冷冻前后精液的超微结构进行了电镜观察。结果如下:1.在冷冻Ⅰ液中添加0.1%的N-AcGA(N-Acetyl-D-Glucosamine,N-乙酰-D-氨基葡萄糖),解冻后精子的活力和顶体完整率最高,分别为50.00%和56.60%;冷冻Ⅱ液中以4%的甘油浓度最好,解冻后精子的活力、质膜完整率和顶体完整率可分别达52.50%、52.08%和77.67%;冷冻液中添加终浓度为10%或20%的卵黄可有效保护精子的活力;在4℃中平衡2h,冻后顶体完整率比对照组(Oh)有显著提高(P＜0.05);分别选取卵黄(15%和20%)、甘油(1%和1.5%)和OEP(Orvus Es Paste,氨基-钠-十二烷基硫酸脂)(0.5%和1%)两个较好的浓度和平衡时间(0h和2h)相互配伍来进行猪精液冷冻,试验发现,在稀释液中添加15%的卵黄、1%的甘油和0.5%的OEP,平衡2h组可获得较好的活力(35%)和顶体完整率(56.38%);添加0-0.64mg/mL谷胱甘肽对精子的活力或顶体没有显著的改善。2.选取6个不同的冷冻高度分别冷冻猪5mL大管精液,检测冻后精子的活力、质膜完整性和顶体完整性,结果发现,1cm组冻后活力和顶体完整率最高,分别为55.00%和80.08%;解冻温度分42℃(30s、40s、50s)、52℃(18s、25s、35s、45s)和60℃(20s、30s、40s)共10个组别,试验结果表明,解冻温度和对应的解冻时间对冻后精子的活力影响不明显,顶体完整性却差异显著,以42℃40s组最佳,为59.50%,并在解冻15分钟后精子活力最高,都在0.4以上。3.本试验比较了颗粒、0.25mL细管和5mL大管三种剂型冷冻猪精液的效果,结果发现,5mL大管冻后活力(40%)、活率(49.58%)、质膜完整率(53.91%)和顶体完整率(52.65%)比0.25mL细管低,但差异不显著;采用5mL大管冻后精液和新鲜精液进行IVF试验,无论是在卵裂率,还是桑椹胚或囊胚率上均不存在显著差异(P＞0.05);本试验还利用颗粒和5mL大管冻后精液进行输精,发现受胎率相当。4。利用扫描电镜技术,研究5mL大管精液超低温冷冻前后猪精子的形态和超微结构,结果发现,冻后精子的顶体膜扣质膜肿胀,大都呈泡状化,部分局部断裂,表明超低温冷冻和升温解冻对猪精子的膜结构损伤严重。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
符号说明  12-14
第一章文献综述  14-26
  1 精液冷冻保存技术研究进展  14-17
    1.1 研究简史  14-16
    1.2 研究现状  16-17
  2 猪精液冷冻保存技术  17-26
    2.1 猪精液冷冻保存技术  17-24
      2.1.1 研究进展  17
      2.1.2 猪精子冷冻特点和冷冻机理  17-18
      2.1.3 猪精液冷冻保存的主要技术环节  18-21
      2.1.4 冷冻剂型  21-22
      2.1.5 检测方法  22-24
    2.2 繁殖新技术  24-25
      2.2.1 精子性别控制技术  24-25
      2.2.2 子宫深部输精技术  25
    2.3 本试验研究的目的和意义  25-26
第二章猪精液5ML大管冷冻保存的冷冻保护剂筛选  26-36
  1 材料与方法  27-29
    1.1 材料  27-28
      1.1.1 试验动物  27
      1.1.2 主要药品及试剂  27
      1.1.3 主要仪器设备及耗材  27-28
    1.2 试验方法  28-29
      1.2.1 精液的采集  28
      1.2.2 精液的稀释与平衡  28
      1.2.3 冷冻精液制作  28-29
      1.2.4 精液解冻  29
      1.2.5 精子指标测定  29
      1.2.6 数据处理  29
  2 结果  29-33
    2.1 不同浓度N-AcGA对猪5mL大管冷冻效果比较  29-30
    2.2 不同浓度甘油对猪5mL大管冷冻影响效果比较  30
    2.3 不同浓度卵黄对猪5mL大管冷冻影响效果比较  30-31
    2.4 不同甘油平衡时间对猪5mL大管冷冻影响效果比较  31-32
    2.5 卵黄、甘油、OEP和平衡时间之间的不同配伍对猪5mL大管冷冻影响效果比较  32-33
    2.6 不同浓度谷胱甘肽对猪5mL大管冷冻影响效果比较  33
  3 讨论  33-36
    3.1 N-乙酰-D-氨基葡萄糖对解冻精子活力和项体形态的影响  33-34
    3.2 甘油对解冻精子活力、质膜完整性和顶体形态的影响  34
    3.3 卵黄对解冻精子活力、质膜完整性和顶体形态的影响  34
    3.4 甘油平衡时间对解冻精子活力、质膜完整性和项体形态的影响  34-35
    3.5 卵黄、甘油、OEP和平衡时间之间的配伍关系对冻后精子品质的影响  35
    3.6 谷胱甘肽对解冻精子活力、质膜完整性和顶体形态的影响  35-36
第三章猪精液5ML大管冷冻和解冻方法的优化  36-40
  1 材料与方法  36-37
    1.1 材料  36
    1.2 方法  36-37
      1.2.1 精液采集  36-37
      1.2.2 精液冷冻  37
      1.2.3 精液解冻  37
  2 结果  37-38
    2.1 不同冷冻高度猪5mL大管冷冻效果比较  37
    2.2 解冻温度对精子活力和项体完整性的影响  37-38
  3 讨论  38-40
    3.1 冷冻高度对解冻精子活力、质膜完整性和顶体形态的影响  38-39
    3.2 解冻温度对精子活力和顶体完整性的影响  39-40
第四章颗粒、0.25ML细管和5ML大管三种剂型冷冻猪精液效果比较  40-47
  1 材料与方法  40-43
    1.1 材料  40-41
      1.1.1 试验动物  40
      1.1.2 主要仪器设备及耗材  40-41
    1.2 方法  41-43
      1.2.1 颗粒、0.25mL和5mL猪冻精的制作和解冻  41-42
      1.2.2 体外受精  42-43
      1.2.3 人工授精  43
      1.2.4 统计与分析  43
  2 结果  43-45
    2.1 比较颗粒、0.25mL细管、5mL大管冷冻及各自冷冻温度曲线  43-44
    2.2 冻精和新鲜精液受精能力的比较  44-45
  3 讨论  45-47
第五章猪精液5ML大管冷冻保存后超微结构观察  47-49
  1 材料与方法  47
  2 结果观察  47-48
  3 讨论  48-49
结论  49-50
参考文献  50-60
附录  60-62
致谢  62-64
攻读学位期间发表的学术论文目录  64

猪精液5mL大管冷冻保存方法的建立及优化

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