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核供体细胞体外培养及其对猪克隆胚生产效率的影响

作　者: 曹爱巧
导　师: 芮荣
学　校: 南京农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 猪体细胞核移植核供体细胞生长曲线重构胚发育
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

体细胞核移植(SCNT)技术具有巨大的应用潜力和发展前景,对于培育优良畜种、生产同质实验动物、保护濒危动物、进行治疗性克隆和转基因动物生产等方面,均有重要理论意义和实用价值,现已有多种体细胞被用以获得克隆后代。体细胞克隆猪在人类动物疾病模型和异种器官移植方面具有巨大的优势和应用潜力,已成为当今体细胞克隆领域研究的热点。虽然体细胞克隆猪业已取得不少进展,但核移植技术仍存在许多问题,如总体效率低、流产率高及克隆动物异常发育等。在哺乳动物体细胞核移植中,供体细胞是影响其效率的主要因素之一。该文着重从供核细胞体外培养、细胞类型、体外传代次数等方面研究供核细胞及其对体细胞核移植效率的影响。采用组织块法和胰酶消化法分离培养4种供核体细胞:猪胎儿成纤维细胞、猪卵丘细胞、猪颗粒细胞及猪耳皮肤成纤维细胞。比较2种方法对上述4种体细胞的冷冻效果,方法A将细胞放在4℃冰箱中平衡0.5 h,-20℃2 h,置于-70℃低温冰箱中过夜后,将细胞冷冻管直接投入液氮中保存。方法B则用细胞冷冻盒进行冷冻保存,将冷冻管放入NALGENE冷冻盒中,置于-70℃低温冰箱中过夜后,将细胞冷冻管直接投入液氮中保存。在用于核移植以前,我们对细胞进行了连续培养,观察其形态学变化;采用MTT法检测其细胞活力,并绘制了细胞生长曲线;同时进行核型分析检测。我们以体外成熟培养40～44 h的去核卵母细胞为受体,体外培养的胎儿成纤维细胞、卵丘细胞、颗粒细胞、耳皮肤成纤维细胞为核供体构建重构胚。重构胚在体外培养7 d,观察其卵裂率及胚胎发育情况。结果表明:1.在所培养的4种体细胞中,采用方法B的细胞存活率和贴壁率均明显高于方法A(P＜0.05),方法B为体细胞冷冻保存的最佳方案。2.所培养的4种体细胞在体外的生长增殖过程均呈“S”型曲线变化,经历了潜伏期、指数增长期和平台期3个阶段,符合细胞在体外生长的一般规律。传代后滞留期较短,约有1 d左右,活细胞逐渐贴壁生长。此后进入对数生长期,延续6 d左右。培养8 d后细胞发生接触抑制而开始死亡,其数量进入平台期,并逐渐脱落死亡,导致数量下降。3.染色体检测表明,在适宜的培养体系胎儿成纤维细胞至少可以传至8代并保持染色体倍性正常,卵丘细胞至少可以传至5代并保持染色体倍性正常;颗粒细胞至少可以传至5代并保持染色体倍性正常;耳皮肤成纤维细胞,至少可以传至6代并保持染色体倍性正常。该结果表明,细胞经传代后均可保持核型稳定正常,适合用作体细胞核移植的供核细胞。4.本实验采用猪胎儿成纤维细胞、卵丘细胞、颗粒细胞及耳皮肤成纤维细胞分别进行核移植,比较不同细胞类型对猪体细胞核移植效率的影响,结果显示核移植后都能得到体细胞克隆的桑囊胚,胎儿成纤维细胞(70.2%)、颗粒细胞(73.3%)和卵丘细胞(82.5%)作为核供体的卵裂率均显著高于耳成纤维细胞(61.2%):颗粒细胞(38.6%)和卵丘细胞(47.6%)所获得的桑囊胚率显著高于耳成纤维细胞(28.4%,P＜0.05)。5.以不同代次的猪胎儿成纤维细胞、颗粒细胞及耳成纤维细胞为核供体进行核移植,比较不同传代次数对核移植效率的影响。结果显示以猪胎儿成纤维细胞不同培养代数做供体进行核移植,第2代的猪胎儿成纤维细胞(79.0%)作为核供体细胞获得的卵裂率显著高于第3代(58.1%,P＜0.05),而两者获得的桑椹胚、囊胚发育率差异不显著。用传至3代的颗粒细胞作核供体的卵裂率显著低于原代及前2代细胞(P＜0.05);但在桑裘胚发育率上,第2代的细胞显著高于其它代次(P＜0.05)。用不同代次的耳成纤维细胞作为核供体获得的卵裂率差异不显著,但在桑囊胚发育率上,原代(36.8%)及第3代细胞(44.1%)显著高于第1代(10.5%)和第2代(13.5%)细胞(P＜0.05)。6.本实验获取作为供核细胞的猪卵丘细胞方法有2种。(1)直接从成熟卵母细胞周围分离得到卵丘细胞;(2)卵丘细胞经过体外培养传代4代的卵丘细胞,以重建胚早期发育率为指标,比较2种供核细胞对猪核移植效果的影响。结果表明,直接分离的卵丘细胞作为核供体获得的卵裂率与培养传代的卵丘细胞差异不显著,而直接分离的卵丘细胞(47.6%)获得的桑囊胚率显著高于传代细胞(22.2%)。因此,直接从成熟卵母细胞周围分离得到的卵丘细胞,可以作为核供体进行核移植。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-12
英文缩略表  12-13
第一部分文献综述  13-38
  第一章核供体细胞与体细胞核移植  13-38
    1. 体细胞核移植的理论基础  14
    2. 核供体细胞的体外培养对哺乳动物核移植效率的影响  14-23
      2.1 体细胞的来源及分化程度对核移植效率的影响  14-15
      2.2 用于核移植的核供体细胞类型  15-17
      2.3 供体细胞类型对核移植效率的影响  17-18
      2.4 体细胞的传代培养对核移植效率的影响  18-19
      2.5 体细胞的细胞周期对核移植效率的影响  19-20
      2.6 供体细胞重新编程  20
      2.7 体细胞的克隆效率  20-22
      2.8 体细胞的冷冻与保存  22-23
    3. 体细胞核移植技术  23-25
      3.1 核移植受体胞质的准备  23
      3.2 体细胞的制备  23-24
      3.3 供体细胞的注入与融合  24-25
      3.4 克隆后卵母细胞的激活  25
      3.5 胚胎的体外培养  25
    4. 体细胞核移植存在的问题  25-26
    5. 哺乳动物体细胞核移植的应用前景  26-29
      5.1 体细胞核移植研究在基础科学研究中的作用  26-27
      5.2 体细胞核移植研究在医学领域的作用  27-28
      5.3 体细胞核移植与动物保护  28
      5.4 体细胞核移植在畜牧生产中的作用  28
      5.5 提供实验动物  28-29
    参考文献  29-38
第二部分实验研究  38-79
  第二章核供体细胞体外培养及生物学特性研究  38-64
    1 材料与方法  38-41
      1.1 材料  38-39
      1.2 主要仪器设备  39
      1.3 主要试剂和药品  39-40
      1.4 主要试剂的配制  40-41
    2 实验方法  41-45
      2.1 体细的分离与培养  41-43
      2.2 传代培养  43
      2.3 HE染色  43
      2.4 细胞的冻存  43
      2.5 细胞的复苏  43
      2.6 细胞生物学特性  43-44
      2.7 试验设计  44-45
      2.8 数据统计与分析  45
    3 结果  45-55
      3.1 体细胞的分离与培养  45-51
      3.2 HE染色结果  51-52
      3.3 几种供核细胞的生长曲线  52-53
      3.4 不同冷冻方法对猪体细胞培养的影响  53-55
      3.5 染色体核型分析  55
    4 讨论  55-61
    参考文献  61-64
  第三章核供体细胞对猪体细胞核移植效率的影响  64-79
    1 材料  64-66
      1.1 猪卵巢来源  65
      1.2 主要仪器设备  65
      1.3 主要试剂及药品  65
      1.4 主要试剂的配置  65-66
    2 方法  66-69
      2.1 猪卵母细胞采集  66-67
      2.2 猪卵泡液(porcine forllicular fluid,pFF)制备  67
      2.3 卵母细胞体外成熟  67
      2.4 核供体细胞的制备  67
      2.5 卵母细胞去核与注核  67-69
      2.6 融合和激活  69
      2.7 重构胚胎的体外培养  69
      2.8 试验设计  69
      2.9 数据统计与分析  69
    3 结果  69-73
      3.1 体细胞核移植胚胎生产程序的建立  69-70
      3.2 不同核供体细胞对体细胞核移植的影响  70-71
      3.3 不同传代次数对核移植的影响  71-72
      3.4 直接分离的卵丘细胞核和培养传代的卵丘细胞对体细胞核移植的影响  72-73
    4 讨论  73-76
    参考文献  76-79
全文结论  79-80
致谢  80

核供体细胞体外培养及其对猪克隆胚生产效率的影响

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