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伴随着基因结构和基因功能研究的深入开展,尤其是“人类基因组项目”完成后,对于人类相关疾病的基因诊断和基因治疗的研究迈入了一个新的纪元,但其首要条件在于对致病基因碱基序列的识别和确定。而传统的DNA测序方法存在一些局限,比如,劳动强度大且消耗时间较长。但是随着Watson-Crick对碱基互补配对原则的深入探究,为分子生物学的相关研究和开发提供了一个全新的基因检测方法-DNA探针。其中,以杂交技术为基础的DNA探针技术,当结合一些标记方法,比如,荧光法,电化学法,化学发光法后,将会使DNA探针得到一定程度的优化使用,比如,免去了放射性物质对人体的危害；降低了标记物昂贵的价格；节省了操作时间等,具有特异性好,快速灵敏,操作简便和无污染等特点,且还具有分离纯化基因及分子识别的功能。目前这种类型的分子探针已经成为基因研究领域中最具有吸引力的课题之一。最关键的问题在于怎样找出导致各种各样基因疾病的基因,并且具有高灵敏度和高选择性。目前检测DNA的错配差异性最有用的工具是分子信标,其和线形信标相比,具有高的目标选择性,因为信标分子特殊的茎环结构使得在检测前多了一步打开茎环结构进而才与目标物进行杂交反应的过程。因此在某种程度上提高了选择性。在本论文中,我们设计了一种新型的电化学分子信标,将之命名为“新型电化学活性开关分子信标”,其作用机理类似于传统的以荧光基团-猝灭基团为基础的分子信标。在此,我们使用了具有二聚能力的卟啉铁分子,并将其连接在分子信标两端,在没有目标分子存在时,连接在信标两端的完全相同的卟啉铁分子因为受到茎环的作用力而无限靠近,因此呈现二聚状态,此时表现出非电化学活性特征,电化学信号被抑制；当加入目标分子时,分子信标将于目标序列互补结合,此时分子灯塔被迫使打开,连接在其上的两个卟啉铁分子也同时被强制分开,破坏了卟啉铁的二聚体结构而使卟啉铁以单体状态存在,因此此时电信号恢复。这种类型的信标既具有传统荧光信标简单快捷、易于控制的特点,又具有电化学技术成本低廉、易于小型化、便于野外操作的优势。论文分为三章：第一章：绪论以杂交技术为基础的DNA探针技术,结合一些标记方法后,比如,荧光方法,电化学方法,化学发光方法后,使DNA探针得到一定程度的优化,为分子生物学的相关研究和开发提供了一个全新的基因检测方法.分子信标技术以其高选择性及特异性成为目前基因研究领域中的热点之一。本章通过对分子信标技术,主要从荧光分子信标和电化学分子信标及卟啉铁的性质及应用的归纳及总结,详细说明了本论文所研究课题的理论基础和选题依据。最后阐述了本论文的目的意义及创新之处。第二章：Hemin电化学开关行为的探讨和Hs-MB电化学活性开关分子信标的合成研究众所周知,hemin是一种高度疏水性的分子,在中性和弱碱性溶液中具有较左的溶解性,大量的科研数据已经证明：hemin溶液的物理和化学性质随着它的聚集状态的改变而改变,因为hemin的结构中存在疏水性基团乙烯基,致使hemin的卟啉结构部分聚集趋势相当明显。本章通过实验证明hemin的单体和二聚体的电信号值存在很大的差异,可以将其用在新型电化学活性分子开关上。同时,通过采用各种方法对所合成的新型电化学活性开关分子信标进行表征。实验结果表明,合成出的分子信标良好,为新型信标在生物化学领域中的应用奠定了基础。第三章：基于Hs-MB型电化学活性开关分子信标的应用研究p53基因是一种重要的致癌基因。据文献报道,人类50%的肿瘤是因为存在p53基因的突变或缺失,因此p53丛因的检测就显得至关重要。在本章中,我们首先合成了一种Hs-MB型电化学活性开关分子信标,这种类型的信标分子在未加目标分子的情况下没有电化学信号,但当与完全互补杂交序列发生杂交反应后则产生电化学信号,并将其应用于p53基因的定性、定量检测及其SNP突变的识别。实验结果证明,电化学检测DPV的峰电流值与目标DNA的浓度之间有良好的线性关系,回归方程为y=8E-08x+2E-07(x为目标序列的浓度,y为响应的峰电流值,R=0.9861),得到其最低检测限为3nmol。且对一碱基错配序列与完全互补序列的响应信号有较明显的差异性,初步证明,该分子信标可以实现对目标分子的定量检测和SNP突变的识别上。
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