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深海菌株Bacillus sp. EPPRO6蛋白酶基因多样性、克隆表达及酶学性质分析

作　者: 徐辉
导　师: 曾润颖
学　校: 国家海洋局第三海洋研究所
专　业: 微生物学
关键词: 深海沉积物 蛋白酶 克隆表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


从太平洋深海沉积物筛选到一株产蛋白酶的菌株Bacillus sp. EPPRO6,该细菌细胞在电子显微镜下呈短杆状,无鞭毛,单个排列,大小为1.6~1.8μm×2.5~3.0μm,为革兰氏阳性菌。该菌能够利用多种碳源和氮源并产生蛋白酶,尤其在酪蛋白底物的诱导作用下,该菌株能够产生大量胞内的蛋白酶。粗酶液经硫酸铵盐析,Sephadex G-75凝胶柱层析后,获得了单一条带的电泳纯酶,其分子量大小约为34 kDa,并对纯化后的蛋白酶进行酶学性质的研究。该蛋白酶的最适反应pH值为8~9,最适反应温度为60℃,是典型的中温碱性蛋白酶,对热不敏感,具有很高的热稳定性,60℃保温1h后酶活仍剩余50%,Ca2+能够很大程度上提高该蛋白酶的热稳定性。Co2+,Mg2+,Ca2+等离子对蛋白酶有较为明显的激活作用,Fe3+、Hg2+、Cu2+等则能抑制蛋白酶活力。10 mmol/L的金属离子螯合剂EDTA和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF对该蛋白酶显示一定的抑制作用,而半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对此酶无抑制作用,该酶有一定耐受尿素和二巯基丁二醇的能力。利用PCR技术扩增出了相关蛋白酶的8个基因片段,并采用染色体步移的方法获得了5个相关蛋白酶的开放阅读框(ORF),进行序列比对和保守区域分析后,分别为胞内丝氨酸蛋白酶,肽酶M4,CAAX氨基末端蛋白酶,中性蛋白酶B和微生物胶原蛋白酶。根据完整的蛋白酶基因,设计了表达引物,构建重组质粒,转化到E.coli BL21中,其中3个蛋白酶基因得到了表达,蛋白质电泳结果显示,表达出的蛋白质均符合预期的大小。其中胞内丝氨酸蛋白酶获得可溶性表达,并经酶活检验,均有丝氨酸蛋白酶的性质。本实验中尝试利用传统的紫外诱变的方法,对该野生型菌株诱变,获得理想中的更加耐碱或者耐酸的高稳定性的菌株。该菌株产生的蛋白酶,种类多,活力高,稳定性良好,具有潜在的工业应用价值。

全文目录


摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
1 前言  11-25
  1.1 深海的应用前景  11
  1.2 微生物蛋白酶的简介  11-13
  1.3 碱性蛋白酶的研究进展  13-17
    1.3.1 碱性蛋白酶的来源及国内外研究现状  13-14
    1.3.2 碱性蛋白酶的作用  14-17
  1.4 金属蛋白酶的研究进展  17-19
    1.4.1 金属蛋白酶的来源及研究现状  17-18
    1.4.2 微生物金属蛋白酶的应用  18-19
  1.5 高产蛋白酶菌株的选育  19-22
    1.5.1 利用传统的物理、化学因子单独或复合诱变选育高活力菌株  19
    1.5.2 原生质体技术选育碱性蛋白酶高产菌株  19-20
    1.5.3 利用基因工程技术选育高产菌株的选育  20
    1.5.4 蛋白质工程  20-22
  1.6 新型蛋白酶的发现  22-23
  1.7 本课题的研究目的意义  23-25
2. 材料与方法  25-51
  2.1 材料  25-35
  2.2 基本方法  35-42
  2.3 产蛋白酶菌株的筛选鉴定与系统发育分析，理化特性及其发酵条件和酶学性质的研究  42-45
  2.4 菌株BACILLUS SP. EPPRO6 蛋白酶基因的克隆和表达纯化  45-51
3 结果与分析  51-97
  3.1 产蛋白酶菌株的筛选鉴定与系统发育分析，理化特性及其发酵条件和酶学性质的研究  51-62
    3.1.1 菌株Bacillus sp. EPPRO6 的筛选及形态特征  51-52
    3.1.2 菌株Bacillus sp. EPPRO6 的16s rDNA 序列分析及系统发育树构建  52-53
    3.1.3 菌株Bacillus sp. EPPRO6 的生长曲线和产酶曲线  53-55
    3.1.4 菌株Bacillus sp. EPPRO6 发酵条件研究  55-56
    3.1.5 粗酶制备及初步纯化  56-57
    3.1.6 蛋白酶的酶学性质分析  57-62
  3.2 BACILLUS SP. EPPRO6 蛋白酶基因的克隆和表达纯化  62-97
    3.2.1 蛋白酶基因小片段的扩增  62-63
    3.2.2 ORF1蛋白酶基因的克隆和表达纯化  63-71
    3.2.3 ORF2蛋白酶基因的克隆和表达  71-77
    3.2.4 ORF3蛋白酶基因的克隆和表达  77-82
    3.2.5 ORF4蛋白酶基因的克隆和表达  82-89
    3.2.6 ORF5蛋白酶基因的克隆和表达  89-97
4 讨论和总结  97-104
  4.1 菌株BACILLUS SP.EPPRO6 的筛选鉴定及其蛋白酶的特性  97-99
  4.2 菌株BACILLUS SP. EPPRO6 的蛋白酶基因的克隆表达  99-101
  4.3 工程菌表达的蛋白酶和野生型菌株蛋白酶的比较分析  101-102
  4.4 蛋白酶的改造  102-104
参考文献  104-110
硕士期间发表的文章  110-111
致谢  111

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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