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糙米发芽过程中内源蛋白酶特性及主要含氮物质变化研究

作　者: 李翠娟
导　师: 顾振新
学　校: 南京农业大学
专　业: 农产品加工与贮藏工程
关键词: 糙米发芽内源蛋白酶特性蛋白质降解
分类号: TS210.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本研究选用江苏本地广泛种植的粳稻为原料,采用浸润发芽的方式,以酪蛋白或明胶为底物,通过溶液测定法和凝胶电泳技术,研究了糙米发芽过程中蛋白酶活力的变化,确定发芽糙米内源蛋白酶的基本特性,考察了发芽过程中生理指标变化,并分析了发芽过程中含氮物质变化和蛋白酶活力变化之间的相关性。研究结果如下：以酪蛋白为底物,研究了发芽糙米蛋白酶基本特性,结果表明：发芽糙米蛋白酶包含酸性和碱性两个活性基团,最适pH分别为3.5和8.0,最适温度为40℃,对酪蛋白的Km值分别为0.404 mg/mL和3.889 mg/mL。酸性蛋白酶活力可被Ba2+和Pb2+抑制,被Zn2+激活；碱性蛋白酶被Ca2+和Pb2+抑制,Mg2+和Zn2+则对其有促进作用。抑制剂检验显示：Pepstain A (Pep A)和碘乙酸(IAA)很大程度抑制了酸性蛋白酶活力,表明发芽糙米蛋白酶中存在天门冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶；金属蛋白酶则在碱性条件下可发挥较大的作用(金属离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)和1,10-菲啰啉(1,10-Phe)的抑制率达88.37%和74.82%)。还原剂L-半胱氨酸(L-Cys)、β-巯基乙醇(β-ME)和二硫苏糖醇(DTT)可显著提高发芽糙米酸性蛋白酶活力；碱性蛋白酶对底物酪蛋白的降解作用不受L-Cys和β-ME的影响,而DTT则对其有抑制作用。在酪蛋白为底物测定的基础上,以明胶为底物,采用凝胶电泳技术考察发芽糙米内源蛋白酶活性条带特征,结果表明：随着电泳的迁移,在pH 3.5和8.0时,发芽糙米蛋白酶分别有两条活性条带出现,且碱性蛋白酶条带检测到的时间早于酸性；抑制剂检测表明,酸性酶活条带为半胱氨酸蛋白酶,碱性酶活条带为金属蛋白酶；还原剂对两种蛋白酶活力条带表现出正效应或负效应；Mn2+可以解除EDTA对金属蛋白酶的抑制作用,且不受离子浓度影响；低浓度(0.5～1.0 mmol/L)Zn2+也可恢复由EDTA抑制的酶活力,但高浓度(5.0～7.5 mmol/L)时则起抑制作用。糙米发芽过程中,随发芽时间延长,芽长、发芽率、呼吸强度和干物质损失率逐渐增加,酸性蛋白酶活力呈先升高后降低的趋势,发芽前4 d内,碱性蛋白酶活力升高显著,之后变化趋于平缓；随着储藏蛋白的降解,肽含量逐渐增加,可溶性蛋白和游离氨基酸呈先升高后降低的趋势；至发芽结束,清蛋白和球蛋白含量显著降低,尤其在前5 d内降解迅速,SDS-PAGE电泳显示,两种蛋白组分中均有分子量较大亚基被完全降解；5 d后,谷蛋白含量开始下降,电泳显示57 KDa亚基降解显著；相关性分析表明：糙米发芽7 d,酸性蛋白酶同可溶性蛋白、肽含量、游离氨基酸呈显著正相关,碱性蛋白酶同可溶性蛋白和肽含量呈正相关,球蛋白与两种蛋白酶体系之间均呈显著负相关。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-11引言 11-12第一章文献综述 12-32 1 糙米发芽过程中生理生化变化 12-15 1.1 呼吸作用 12 1.2 酶系统的形成和激活 12-13 1.3 储藏物质的代谢 13-15 2 蛋白酶 15-20 2.1 蛋白酶分类 15-16 2.2 影响蛋白酶活力的因素 16-19 2.2.1 底物 16-17 2.2.2 pH 17 2.2.3 温度 17 2.2.4 金属离子 17-18 2.2.5 抑制剂和还原剂 18-19 2.2.6 其他因素 19 2.3 蛋白酶活力测定方法 19-20 2.3.1 溶液测定方法 19 2.3.2 凝胶电泳技术 19-20 3 谷物种子内源蛋白酶研究进展 20-23 3.1 大麦 21 3.2 高粱 21-22 3.3 玉米 22 3.4 水稻 22-23 4 谷物种子发芽过程中蛋白质的降解 23-25 4.1 蛋白质降解过程 23-24 4.2 蛋白质降解的调控 24-25 5 本研究目的意义及主要研究内容 25-27 5.1 本研究目的意义 25-26 5.2 主要研究内容 26-27 参考文献 27-32第二章发芽糙米内源蛋白酶特征研究 32-48 1 材料与方法 32-36 1.1 试验材料 32-33 1.2 试验试剂 33-34 1.3 试验仪器 34 1.4 糙米主要成分分析 34-35 1.5 糙米发芽工艺 35 1.6 实验设计 35-36 1.6.1 酪氨酸吸收光谱验证 35 1.6.2 最适pH及pH稳定性测定 35 1.6.3 最适温度及热稳定性测定 35 1.6.4 动力学常数测定 35 1.6.5 金属离子的影响 35-36 1.6.6 有机物的影响 36 1.6.7 抑制剂的影响 36 1.7 蛋白酶活力测定方法 36 1.8 数据统计与分析 36 2 结果与分析 36-44 2.1 酪氨酸紫外吸收光谱 36-37 2.2 发芽糙米内源蛋白酶基本特征 37-41 2.2.1 pH的影响 37-39 2.2.2 温度的影响 39-40 2.2.3 底物浓度的影响 40-41 2.3 金属离子对发芽糙米蛋白酶活力的影响 41-42 2.4 抑制剂对发芽糙米蛋白酶活力的影响 42-43 2.5 还原剂对发芽糙米蛋白酶活力的影响 43-44 3 讨论 44-45 4 本章小结 45-46 参考文献 46-48第三章糙米发芽过程中内源蛋白酶活性条带变化研究 48-62 1 材料和方法 48-51 1.1 试验材料 48 1.2 主要试剂 48-49 1.3 主要仪器 49 1.4 发芽工艺 49 1.5 蛋白酶提取与电泳分析 49-50 1.6 实验设计 50-51 1.6.1 反应pH对发芽糙米蛋白酶活性条带的影响 50 1.6.2 反应温度对发芽糙米蛋白酶活性条带的影响 50 1.6.3 还原剂对发芽糙米蛋白酶活性条带的影响 50 1.6.4 抑制剂对发芽糙米蛋白酶活性条带的影响 50-51 1.6.5 金属离子对EDTA抑制酶活的恢复作用 51 2 结果与分析 51-58 2.1 PH对发芽糙米蛋白酶活性条带的影响 51-52 2.2 发芽糙米酸性蛋白酶活性条带变化 52-55 2.2.1 发芽时间的影响 52-53 2.2.2 反应温度的影响 53 2.2.3 抑制剂敏感性研究 53-54 2.2.4 还原剂敏感性研究 54-55 2.3 发芽糙米碱性蛋白酶活性条带变化 55-58 2.3.1 发芽时间的影响 55-56 2.3.2 反应温度的影响 56 2.3.3 还原剂敏感性研究 56-57 2.3.4 抑制剂敏感性研究 57 2.3.5 金属离子对EDTA抑制酶活的恢复作用 57-58 3 讨论 58-59 4 本章小结 59-60 参考文献 60-62第四章糙米发芽过程中主要含氮物质变化研究 62-78 1 材料与方法 62-64 1.1 试验材料 62 1.2 试验试剂 62-63 1.3 试验仪器 63 1.4 发芽工艺 63 1.5 蛋白组分提取 63 1.6 测定指标与方法 63-64 1.6.1 生理指标 63 1.6.2 常规指标 63-64 1.6.3 蛋白酶活力 64 1.6.4 蛋白组分亚基 64 1.7 数据分析方法 64 2 结果与分析 64-73 2.1 糙米发芽过程中生理变化 64-65 2.2 糙米发芽过程中蛋白酶活力变化 65-66 2.3 可溶性蛋白、肽和游离氨基酸含量变化 66 2.4 蛋白组分含量变化 66-67 2.5 蛋白组分亚基变化 67-71 2.5.1 清蛋白亚基变化 67-68 2.5.2 球蛋白亚基变化 68-69 2.5.3 醇溶蛋白亚基变化 69-70 2.5.4 谷蛋白亚基变化 70-71 2.6 相关性分析 71-73 3 讨论 73-74 4 本章小结 74-75 参考文献 75-78全文结论 78-80致谢 80-82攻读硕士学位期间发表论文 82

糙米发芽过程中内源蛋白酶特性及主要含氮物质变化研究

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