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慢病毒介导shRNA稳定持续抑制口蹄疫病毒增殖的两类细胞系的建立

作　者: 魏衍全
导　师: 刘湘涛
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: RNAi 口蹄疫病毒抑制 shRNA 慢病毒
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

RNA干扰(RNAi)是广泛存在于生物界的一种由内源性或外源性双链RNA分子诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象,是许多生物具有的对抗入侵的核酸,保护自身的天然机制。诱发RNAi的最关键分子是长度为19~27bp的双链RNA,被称为小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)。随着RNAi机制及其应用研究的不断深入,人们发现无论体内还是体外试验,siRNA均能够抑制多种病毒的增殖。近年来,许多学者以人工诱导RNAi的方式进行了病毒复制的干扰研究,取得了良好进展,因此RNAi技术被认为是最有应用价值的抗病毒感染方法之一。口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的多种偶蹄动物共患的急性传染病,被国际兽疫局列为A类传染病之首。由于口蹄疫病毒非常容易发生变异,导致新的变异株不断出现、更迭,传统的疫苗免疫等措施不能有效地应对口蹄疫的爆发和流行。RNAi现象的发现及其在抗病毒方面的研究进展,为FMD的防制研究开辟了一个新的探索领域。本研究针对口蹄疫病毒的体外复制进行了RNA干扰的成功探索。FMDV的2B和3D基因在FMDV不同血清型和亚型中非常保守,根据美国Invitrogen公司提供的siRNA在线设计结果,针对2B和3D区段设计并合成了5个shRNA模板,同时设计了一个无关对照shRNA模板,分别克隆到shRNA表达载体的U6启动子下游,构建了6个相应的shRNA表达质粒。首先,从细胞水平研究了shRNA表达载体对3D基因表达的抑制作用,将3D基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组的融合表达质粒pEGFP+3D。将针对3D基因的4个干扰质粒分别与pEGFP+3D共转染PK-15细胞,经荧光显微镜观察、流式细胞仪和real-time RT-PCR分析,表明pEN/U6-3D1、pEN/U6-3D2、pEN/U6-3D3和pEN/U6-3D4对3D基因的表达有一定的抑制作用,其中pEN/U6-3D2和pEN/U6-3D4的效果较为突出。然后将pEN/U6-3D2, pEN/U6-3D4, pEN/U6-2B和pEN/U6-CON进行LR重组生成对应的pEX/U6-3D2, pEX/U6-3D4, pEX/U6-2B和pEX/U6-CON。接着将重组后的表达载体在转染试剂介导下和辅助质粒一同转染293FT细胞,在转染后50h时收获慢病毒。将上述慢病毒转染原代羊胚胎成纤维细胞和PK-15细胞,48h时换成带有抗性的培养液进行筛选,14天左右的时间获得单克隆细胞株,扩大培养后保存各细胞株,其中FMDV特异性shRNA稳定表达细胞株6株,阴性对照shRNA稳定表达细胞株2株,提取上述细胞株的基因组经PCR鉴定确实为shRNA转基因阳性克隆。最后利用观察CPE、TCID50测定、间接免疫荧光试验和real-time PCR等方法检验了上述细胞株对FMDV增殖的抑制效果。结果显示,阴性对照克隆和未转基因的空白对照在接种病毒24h后,两株细胞克隆的感染率均比稳定整合FMDV特异性干扰序列的阳性细胞克隆的感染率高,并且二者差别显著。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-13
第一章绪论  13-26
  1.1 当前口蹄疫的分布和流行  13-14
    1.1.1 口蹄疫概述  13
    1.1.2 口蹄疫的分布和流行  13-14
  1.2 口蹄疫病毒基因组基本结构及其特性  14-19
    1.2.1 5' 非翻译区(5'-UTR)  16
      1.2.1.1 VPg、S 片段和poly (C)  16
      1.2.1.2 PKs、IRES 和cre  16
    1.2.2 开放读码框(ORF)  16-18
      1.2.2.1 引导蛋白酶( Leader proteinase, L~(pro))  17
      1.2.2.2 结构蛋白P1 编码区  17
      1.2.2.3 非结构蛋白P2、P3 编码区  17-18
    1.2.3 3'非翻译区(3'-UTR)  18-19
  1.3 RNAI 实现方法及在免疫相关基因功能鉴定中的应用  19-25
    1.3.1 RNAi 转运方式  19-22
      1.3.1.1 理化介导法  19-20
      1.3.1.2 质粒DNA 载体法  20-21
      1.3.1.3 病毒载体法  21-22
    1.3.2 siRNA 细胞内形成方式  22-23
      1.3.2.1 直接化学合成  22
      1.3.2.2 体外转录合成  22
      1.3.2.3 由RNaseⅢ催化长的dsRNA 得到siRNA  22
      1.3.2.4 由表达载体在细胞内表达siRNA  22-23
      1.3.2.5 由PCR 来源的siRNA 表达盒在细胞内表达siRNA  23
    1.3.3 RNAi 在免疫相关基因功能鉴定中的进展  23-25
      1.3.3.1 RNAi 技术鉴定基因功能的原理  23-24
      1.3.3.2 RNAi 在免疫相关基因功能鉴定中的应用进展  24-25
    1.3.4 现存问题及展望  25
  1.4 本研究的目的和意义  25-26
第二章口蹄疫病毒SHRNA 的设计及表达载体的构建  26-34
  2.1 材料与方法  26-31
    2.1.1 主要试剂、载体及菌种  26
    2.1.2 主要溶液及配制  26-27
    2.1.3 FMDV 基因组2B 和3D 基因序列的同源性分析和shRNA 靶序列的选择  27
    2.1.4 shRNA 表达模板的设计和合成  27-28
    2.1.5 表达shRNA 的DNA 插入片段的载体构建  28-29
    2.1.6 pEN/U6-shRNA 表达质粒的构建及鉴定  29-30
    2.1.7 重组质粒的大量提取和纯化  30-31
  2.2 结果  31-32
    2.2.1 FMDV 基因组2B 和3D 序列同源性分析结果  31
    2.2.2 靶序列的初步筛选结果  31
    2.2.3 重组载体pEN/U6-shRNA 的鉴定  31
    2.2.4 重组质粒的大量制备与纯化  31-32
  2.3 讨论  32-34
    2.3.1 关于干扰靶区的确定  32
    2.3.2 关于shRNA 序列的选择和制备  32-34
第三章口蹄疫病毒3D 基因与增强型绿色荧光蛋白的真核共表达  34-39
  3.1 材料和方法  34-36
    3.1.1 细胞、菌株、载体及毒株  34
    3.1.2 试剂  34
    3.1.3 引物设计及合成  34-35
    3.1.4 病毒RNA 的提取和RT-PCR  35
    3.1.5 真核共表达质粒pEGFP+3D 的构建  35
    3.1.6 重组质粒转染PK-15 细胞  35
    3.1.7 EGFP 相对表达分析  35
    3.1.8 3D 基因转录水平的检测  35-36
  3.2 结果  36-38
    3.2.1 3D 基因的RT-PCR 扩增  36
    3.2.2 重组质粒pEGFP+3D 的鉴定  36
    3.2.3 EGFP 在PK-15 细胞内的表达  36
    3.2.4 EGFP 的相对表达分析  36-37
    3.2.5 3D 基因转录水平检测结果  37-38
  3.3 讨论  38-39
第四章质粒表达的SHRNA 对保守基因在PK-15 细胞中表达的抑制  39-43
  4.1 材料和方法  39-40
    4.1.1 载体、感受态细菌、细胞株和毒株  39
    4.1.2 主要试剂及仪器设备  39
    4.1.3 细胞培养用溶液  39
    4.1.4 pEN/U6-shRNA 和pEGFP+3D 无内毒素超纯质粒的提取  39-40
    4.1.5 pEGFP+3D 质粒与pEN/U6-shRNA 质粒共转染  40
    4.1.6 对靶基因对应蛋白表达的抑制效果  40
      4.1.6.1 荧光显微镜观察  40
      4.1.6.2 流式细胞仪检测  40
  4.2 结果  40-42
    4.2.1 荧光显微镜观察shRNA 表达质粒对EGFP+3D 融合蛋白表达的抑制效果  40
    4.2.2 流式细胞术检测shRNA 表达质粒对EGFP+3D 融合蛋白抑制效果  40-42
  4.3 讨论  42-43
第五章慢病毒介导的SHRNA 靶向干扰FMDV 保守基因稳定细胞株的建立  43-51
  5.1 材料与方法  43-46
    5.1.1 试剂、菌种及载体  43
    5.1.2 细胞及其培养  43
    5.1.3 pLenti6/Dest 慢病毒表达载体的构建及鉴定  43-44
      5.1.3.1 LR 重组反应  43-44
      5.1.3.2 重组体转化感受态细胞及阳性质粒鉴定  44
    5.1.4 慢病毒的包装  44
    5.1.5 Blasticidin 细胞致死浓度的确定  44
    5.1.6 转基因阳性细胞克隆的筛选  44
    5.1.7 shRNA 整合基因组的单克隆细胞株的PCR 鉴定  44-45
    5.1.8 转基因阳性细胞的抗病毒试验  45-46
      5.1.8.1 转基因阳性细胞接毒  45
      5.1.8.2 间接免疫荧光检测抗病毒水平  45
      5.1.8.3 TCID_(50) 测定转基因阳性细胞抗病毒效果  45
      5.1.8.4 real-time RT-PCR 检测转基因阳性细胞中FMDV 复制的抑制效果  45-46
  5.2 结果  46-49
    5.2.1 pEX/U6-shRNA 表达质粒干扰序列测序鉴定  46
    5.2.2 两种细胞杀稻瘟菌素最小致死浓度的确定  46
    5.2.3 shRNA 表达盒整合鉴定  46
    5.2.4 转基因阳性细胞克隆的获得  46-47
    5.2.5 转基因阳性细胞接毒后细胞病变效应(CPE)观察结果  47-48
    5.2.6 间接免疫荧光检测转基因阳性细胞的抗病毒效果  48
    5.2.7 TCID_(50) 测定转基因阳性细胞抗病毒水平  48
    5.2.8 real-time RT-PCR 检测转基因阳性细胞中FMDV 复制的抑制效果  48-49
  5.3 讨论  49-51
    5.3.1 细胞转染和稳定筛选  49-50
    5.3.2 转基因阳性细胞克隆的培养和鉴定  50
    5.3.3 转基因阳性细胞克隆抑制FMDV 复制的检测  50-51
第六章全文结论  51-52
参考文献  52-57
致谢  57-58
作者简介  58

慢病毒介导shRNA稳定持续抑制口蹄疫病毒增殖的两类细胞系的建立

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