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沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌多重荧光定量PCR快速检测方法的研究

作　者: 魏琼
导　师: 陈萍
学　校: 吉林农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 沙门氏菌 志贺氏菌 金黄色葡萄球菌 增菌培养基 多重荧光定量PCR
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigellae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是导致食物中毒的主要病原菌,是食品安全风险预测和危害评估中重要监测项目,也是我国酱油、酱、冷冻饮品、熟肉制品、蛋制品、乳制品等多类食品检测标准中致病菌检测必检指标。针对这三种致病菌,建立一种快速准确的检测方法,既可满足实际检测需要,有可改进传统方法存在耗时长,操作繁琐的不足。本研究依据SYBR Green I能和双链DNA结合的特性,利用荧光定量PCR技术优化建立针对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌这三种致病菌的多重荧光定量PCR体系,主要研究包括两部分：1.同时富集沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌增菌培养基的研究根据微生物营养素需求,筛选可添加成分进行单因素比较试验,确定出培养基合适的组分,得到一种能够用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基,当接种量约为10 CFU/mL,37℃培养12h后,三种目标菌以相对一致的速度增殖,可达到107～108 CFU/mL,应用多重PCR可同时扩增出三条目的条带。该复合增菌培养基配制方便、增菌快速、节约成本和时间。2.沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌多重荧光定量PCR检测方法的建立选择沙门氏菌invA基因、志贺氏菌ipaH基因和virA基因、金黄色葡萄球菌Nuc基因和femA基因,设计多对特异性引物,对比分析Tm值差异确定出三对合适的特异性引物组合,并对反应条件进行优化,实现了对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重实时荧光定量PCR检测。检测目标菌菌液DNA的灵敏度分别达到1.68X 102CFU/mL,1.36 X 102CFU/mL和1.24×103CFU/mL,直接检测模拟感染细菌样品的最低检测限为102CFU/g(mL),检测经过12h增菌的模拟样品,最低检测限为1CFU/g(mL)。同时选取目标菌株及非目标菌株进行特异性实验,多重荧光定量PCR体系具有良好的特异性。结果表明,本研究所建立的SYBR Green I多重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度和重复性均达到试验设计要求,为致病菌的检测提供技术手段,具有广泛的应用价值。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章 绪论  8-15
  1.1 研究背景  8-9
  1.2 本研究涉及的三种食源性致病菌的概述  9-10
    1.2.1 沙门氏菌属(Salmonella)  9
    1.2.2 志贺氏菌属(Shigella)  9-10
    1.2.3 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)  10
  1.3 食源性致病菌检测技术概况  10-14
    1.3.1 传统检测方法  11
    1.3.2 免疫学方法  11-12
    1.3.3 分子生物学检测方法  12-13
    1.3.4 快速检测试剂盒概述  13-14
  1.4 试验研究目的与意义  14
  1.5 试验研究的主要内容  14-15
第二章 沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌复合增菌培养基的研究  15-25
  2.1 材料  15-17
    2.1.1 菌株  15
    2.1.2 主要试剂  15-16
    2.1.3 试验仪器与设备  16-17
    2.1.4 培养基的配制  17
  2.2 沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌复合增菌培养基的研究  17-19
    2.2.1 菌悬液的制备  17
    2.2.2 基础培养基的选择  17
    2.2.3 培养基组分单因素筛选  17-18
    2.2.4 增菌效果验证  18
    2.2.5 多重PCR检验  18-19
    2.2.6 受伤菌复苏  19
  2.3 结果与分析  19-23
    2.3.1 基础培养基增菌效果比较  19
    2.3.2 添加单因素效果比较  19-21
    2.3.3 复合培养基单菌增菌生长曲线  21
    2.3.4 复合培养基的增菌效果  21-22
    2.3.5 多重PCR产物扩增  22-23
    2.3.6 受伤菌复苏  23
  2.4 讨论  23-24
  2.5 小结  24-25
第三章 沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌多重荧光定量PCR的建立  25-40
  3.1 材料  25-26
    3.1.1 供试菌种  25-26
    3.1.2 主要试剂  26
    3.1.3 试验仪器与设备  26
  3.2 多重荧光定量PCR体系建立  26-30
    3.2.1 菌株的培养  26
    3.2.2 模板的制备  26-27
    3.2.3 DNA浓度测定  27
    3.2.4 引物的设计与合成  27-28
    3.2.5 引物的筛选与确定  28
    3.2.6 多重荧光定量PCR体系建立  28
    3.2.7 多重荧光定量PCR体系引物浓度优化  28-29
    3.2.8 PCR反应体系的特异性  29
    3.2.9 PCR反应体系的灵敏度  29-30
    3.2.10 市售样品抽样检测  30
    3.2.11 检测程序成本核算  30
  3.3 结果与分析  30-38
    3.3.1 引物的设计与确定  30-31
    3.3.2 多重荧光定量PCR体系优化结果  31-32
    3.3.3 PCR反应体系的特异性  32-34
    3.3.4 检测菌液的灵敏度  34-36
    3.3.5 人工模拟感染食品检测结果  36
    3.3.6 市售样品抽样检测结果  36-37
    3.3.7 检测程序成本计算结果  37
    3.3.8 检测程序规范化操作步骤  37-38
  3.4 讨论  38-39
  3.5 小结  39-40
第四章 结论  40-41
参考文献  41-45
附录  45-46
致谢  46
个人简介  46

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学
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