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金黄色葡萄球菌保护性抗原基因重组牛痘病毒的构建与鉴定研究

作　者: 李贞
导　师: 陈创夫
学　校: 石河子大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 金黄色葡萄球菌 FnBP基因 C1fA基因 牛痘弱毒株病毒 重组牛痘病毒
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


金黄色葡萄球菌是一种能感染多种动物的常见革兰氏阳性球菌。病原学调查表明,金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原之一,对奶牛养殖业的危害较重。为了有效预防奶牛乳房炎的发生,目前迫切需要研究有效的金黄色葡萄球菌疫苗。为此,本项目开展了以下研究工作：1、致奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌SHZ1株保护性抗原基因的克隆与序列分析：利用PCR技术从致奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌SHZl株基因组中扩增出FnBP基因和ClfA基因,克隆至T载体并进行测序。结果表明,金黄色葡萄球菌SHZ1株FnBP基因与Genbank上公布的金黄色葡萄球菌FnBP(序列号为EF127872)的核苷酸序列同源性为99.86%。核苷酸序列中有两个碱基发生变异,但均为同义突变。金黄色葡萄球菌SHZ1株ClfA基因与Genbank上公布的金黄色葡萄球菌ClfA(序列号为EF207779)的核苷酸序列同源性为96%,氨基酸序列的同源性为100%。2、金黄色葡萄球菌FnBP基因重组牛痘病毒的构建、鉴定与纯化研究：将用SamⅠ单酶切将目的基因切下,并克隆至pSCll牛痘病毒载体,测序鉴定正向连接的阳性克隆。选择正向连接的重组转移质粒pSC11-FnBP,利用脂质体转染法将重组转移质粒转染已感染牛痘弱毒株病毒的BHK-21细胞中,收获转染产物,并反复冻融,然后充分稀释接种BHK-21细胞,利用蓝白斑筛选重组牛痘病毒,连续传代纯化蓝色蚀斑,结果传代5次后得到较纯的重组牛痘病毒。利用PCR技术、RT-PCR技术及Western-blotting检测经纯化后得到的重组牛痘病毒,证实外源基因FnBP已成功重组到牛痘弱毒株病毒基因组中,并随着牛痘弱毒株病毒在BHK-21细胞内的生长、繁殖而复制、转录和翻译。3、金黄色葡萄球菌FnBP基因重组牛痘病毒的生长特性、安全性及免疫原性初步研究；利用BHK-21细胞测定非重组牛痘病毒与重组牛痘病毒的毒价(TCID50),结果表明重组外源基因的重组牛痘病毒与非重组牛痘病毒的毒价相比并没有降低。重组牛痘病毒pSC11-FnBP作为实验组,生理盐水和牛痘弱毒株病毒作为对照组,对小鼠进行了实验免疫研究。通过对免疫小鼠体征及内脏器官进行病理切片观察,结果证实重组牛痘病毒pSC11-FnBP对免疫小鼠无任何不良反应,具有良好的安全性。通过检测重组牛痘病毒免疫小鼠血清中IFN-γ和测定中性粒细胞吞噬功能证实构建的重组牛痘病毒与牛痘弱毒株病毒相比可诱导机体产生较好的细胞免疫。攻毒试验表明,重组牛痘病毒对金黄色葡萄球菌具有一定的免疫保护作用。本研究为金黄色葡萄球菌新型疫苗的研究奠定了一定的基础,同时也为奶牛乳房炎的免疫防控研究提供一个新的思路。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-11
英文缩略表  11-12
第一章 文献综述 奶牛乳房炎研究进展  12-22
  1 奶牛乳房炎主动免疫制剂  12-15
    1.1 金黄色葡萄球菌疫苗  12-13
    1.2 链球菌疫苗  13-14
    1.3 大肠杆菌疫苗  14-15
    1.4 卵黄抗体  15
  2 奶牛乳房炎其它防治制剂  15-17
    2.1 抗菌肽  15-16
    2.2 溶菌酶  16
    2.3 中草药制剂  16-17
    2.4 其它制剂  17
  3 致奶牛乳房炎金黄色葡萄菌的研究进展  17-22
    3.1 金黄色葡萄菌引发的奶牛乳房炎  17-18
    3.2 金黄色葡萄菌的毒力因子及保护性抗原  18-22
      3.2.1 金黄色葡萄菌的基因组特征  18-19
      3.2.2 毒力因子  19-20
      3.2.3 保护性抗原的研究进展  20-22
第二章 实验研究  22-61
  实验一 金黄色葡萄球FnBP、ClfA基因的克隆及序列分析  22-37
    1 材料和方法  22-27
      1.1 实验材料  22-23
        1.1.1 菌株、质粒和试剂  22
        1.1.2 主要仪器设备  22-23
      1.2 金黄色葡萄球菌基因组的提取  23-27
        1.3 引物设计与基因片段的PCR扩增  23-27
          1.3.1 引物设计与合成  23
          1.3.2 FnBP基因片段的PCR扩增  23-24
          1.3.3 ClfA基因片段的PCR扩增  24
          1.3.4 目的基因FnBP和ClfA的回收  24
          1.3.5 目的基因FnBP和ClfA与克隆载体的连接  24-25
          1.3.6 连接产物转化E.coli DH_(5a)感受态细胞  25
          1.3.7 pMD18-T-FnBP、pMD18-T-ClfA重组质粒的鉴定  25-27
          1.3.8 目的基因FnBP和ClfA的序列测定及序列分析  27
    2 结果  27-35
      2.1 FnBP和ClfA基因片段的PCR扩增结果  27-28
      2.2 菌液PCR鉴定目的基因FnBP和ClfA重组质粒  28-29
      2.3 FnBP和ClfA基因的克隆及酶切鉴定结果  29-30
      2.4 FnBP和ClfA核苷酸序列的分析  30-35
        2.4.1 FnBP核苷酸序列的分析  30-33
        2.4.2 ClfA核苷酸序列的分析  33-35
    3 讨论  35-37
  实验二 金黄色葡萄球菌FnBP基因重组牛痘病毒的构建蚀斑纯化及其鉴定  37-53
    1 材料和方法  38-44
      1.1 实验材料  38
      1.1.1 菌株、质粒和试剂  38
      1.1.2 主要仪器设备  38
      1.2 金黄色葡萄球菌FnBP基因重组穿梭载体pSC11-FnBP的构建  38-39
        1.2.1 pSC11、pMD18-T-FnBP的酶切  38
        1.2.2 目的基因FnBP与pSC11转移载体的连接  38-39
        1.2.3 连接产物转化E.coli DH_(5a)感受态细胞  39
      1.3 金黄色葡萄球菌FnBP基因重组穿梭载体pSC11-FnBP的鉴定  39-40
        1.3.1 菌落PCR鉴定pSC11-FnBP  39-40
        1.3.2 pSC11-FnBP转移质粒的测序鉴定  40
      1.4 重组牛痘病毒的构建  40-41
        1.4.1 BHK-21细胞的培养  40
        1.4.2 重组转移载体转染BHK-21细胞  40-41
      1.5 重组牛痘病毒pSC11-FnBP的纯化  41
      1.6 重组牛痘病毒pSC11-FnBP的鉴定  41-44
        1.6.1 目的基因FnBP重组牛痘病毒基因组的PCR检测  41-42
        1.6.2 目的基因FnBP转录水平的检测(RT-PCR检测)  42-43
        1.6.3 Western-blotting检验目的基因FnBP的表达  43-44
      1.7 重组牛痘病毒pSC11-FnBP生长特性的检测(TCID_(50)检测)  44
    2 结果  44-50
      2.1 重组穿梭载体pSC11-FnBP的PCR鉴定结果  44-45
      2.2 重组穿梭载体pSC11-FnBP的测序结果  45-46
      2.3 重组牛痘病毒pSC11-FnBP的纯化结果  46-47
      2.4 PCR及RT-PCR检测目的基因FnBP的重组结果  47-48
      2.5 SDS-PAGE凝胶电泳及Western-blotting检测外源基因的表达  48-49
      2.6 TCID_(50)检测牛痘弱毒株病毒与重组牛痘病毒pSC11-FnBP的毒价结果  49-50
    3 讨论  50-53
  实验三 表达金黄色葡萄菌FnBP基因重组牛痘病毒安全性及免疫原性的初步研究  53-61
    1 材料和方法  53-56
      1.1 实验材料  53-54
        1.1.1 菌株、质粒和试剂  53-54
        1.1.2 主要仪器设备  54
      1.2 重组牛痘病毒安全性检测  54-55
        1.2.1 动物免疫  54
        1.2.2 病理变化的检测  54-55
      1.3 重组牛痘病毒免疫原性初步检测  55-56
        1.3.2 小鼠IFN-γ的检测  55
        1.3.3 中性粒细胞吞噬功能的测定  55-56
      1.4 小鼠免疫保护试验  56
    2 结果  56-59
      2.1 小鼠的眼观病理变化结果  56
      2.2 病理组织切片的结果  56-57
      2.3 小鼠IFN-γ的检测结果  57-58
      2.4 中性粒细胞吞噬功能的测定结果  58
      2.5 小鼠免疫保护试验结果  58-59
    3 讨论  59-61
参考文献  61-65
研究结论  65-66
创新点  66-67
附录一:试验路线图  67-68
附录二:载体pSC11的图谱  68-69
附录三:重组穿梭载体构建图  69-70
附录四:主要试剂的配制  70-72
致谢  72-73
研究资助  73-74
作者简介  74-75
导师评阅表  75

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 牛
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