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抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5的功能研究

作　者: 曲小龙
导　师: 胡厚源
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: 动脉粥样硬化 炎症 抗凝 蜱抗凝血肽 金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5 P-选择素糖蛋白配体-1 凝血因子Xa
分类号: R543.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


研究背景及目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一个慢性炎症过程,炎症反应在动脉粥样硬化病变的发生、发展过程中起着关键作用;凝血系统以及血小板的激活也参与其中,进一步促进了动脉粥样硬化及其血栓并发症的发生和发展。本研究将一种能与粒细胞表面P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)结合,并具有抑制“粒细胞-内皮细胞”黏附的蛋白质SSL5 (staphylococcal superantigen-like protein-5,金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5),做为引导兼功能分子,与具有抑制凝血因子Xa(factor Xa , FXa)活性的分子―蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide, TAP)进行融合,制备出重组融合蛋白TAP-SSL5。通过融合使SSL5的抗炎症作用和TAP的抗凝作用相结合,以期为动脉粥样硬化及其血栓并发症的防治提供新的方法。研究方法1、通过PCR技术得到SSL5、TAP基因并克隆入pET32a表达载体,同时通过全基因合成技术合成重组融合蛋白TAP-SSL5的基因,并克隆入及pET22b表达载体,再转染于大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,最后应用离子交换层析或金属离子亲和层析技术进行分离和纯化。2、体外实验部分:以流式细胞仪检测融合蛋白TAP-SSL5在人粒细胞表面的结合情况,及其对小鼠抗人PSGL-1抗体(KPL-1-PE)与粒细胞结合的竞争性抑制作用;以calcein-AM标记中性粒细胞或HL60细胞,检测TAP-SSL5对所标记细胞在P-选择素(P-selectin)包被表面黏附的影响; FXa活性抑制实验采用底物显色法,以S2765为底物,检测TAP-SSL5对FXa活性的抑制作用;同时以蝰蛇毒凝血因子X激活剂(RVV-X)激活人或小鼠血浆FX,进一步检测其对血浆FXa活性的抑制作用。3、动物实验部分:采用氯化铁诱导的大鼠下腔静脉血栓形成模型,研究TAP-SSL5的抗血栓形成作用;采用大鼠颈动脉球囊损伤模型,给予TAP-SSL5(3 mg/kg/d, i.p)三周,对照组给予等量生理盐水,了解TAP-SSL5对血管损伤后新生内膜形成的影响;为研究TAP-SSL5对动脉粥样硬化斑块形成的影响,选取12周龄雄性apoE基因敲除(apoE-/-)小鼠,采用高脂饲养,并同时给予TAP-SSL5(3mg/kg/d, i.p),对照组给予等量生理盐水,每组10只,12周后取小鼠主动脉,检测AS斑块的形成情况,并通过蛋白芯片技术检测血管壁炎症因子的表达水平。结果:1、TAP-SSL5可与粒细胞及HL60细胞结合,并竞争性抑制KPL-1的结合;30μg/ml TAP-SSL5可抑制人中性粒细胞和HL60细胞在P-selectin表面的黏附,抑制率分别为67.9%和81.6%(p<0.001);TAP-SSL5对FXa活性的抑制作用呈浓度依赖性,终浓度为3μM的TAP-SSL5即可对FXa产生显著的抑制作用,采用纯化FXa、小鼠血浆、人血浆检测到的抑制率分别为93.7%、75.5%和94.7%(p<0.001)。2、单次静脉注射3mg/kg的TAP-SSL5,即可显著抑制FeCl3诱导的大鼠下腔静脉血栓形成,抑制率达52.7%(p<0.001);TAP-SSL5可显著抑制大鼠颈动脉损伤后的新生内膜形成,与对照组相比,可使新生内膜面积减少32.0%(p<0.05),使内膜/中膜厚度比值(intima-media thickness ratio)减少41.9%(p<0.001);TAP-SSL5还可有效抑制apoE-/-小鼠AS斑块的形成,且可抑制小鼠主动脉壁中多种炎症因子的表达。结论:重组融合蛋白TAP-SSL5可抑制粒细胞在P-选择素表面的黏附,以及抑制FXa的活性;实验进一步证实TAP-SSL5可抑制血栓形成,抑制动脉血管损伤后新生内膜形成及高脂饲养apoE-/-小鼠AS斑块的形成,这些作用均与TAP-SSL5所具有的抗凝和抗炎症活性有关,重组融合蛋白TAP-SSL5有望成为治疗血管损伤性及血栓性疾病的生物制品类新药。

全文目录


英文缩写词一览表  5-7
英文摘要  7-9
中文摘要  9-11
第一部分 重组融合蛋白TAP-SSL5 表达载体的构建及纯化  11-39
  引言  11-12
  第一节 重组融合蛋白TAP-SSL5 表达载体的构建与鉴定  12-28
    材料与试剂  12-14
    方法  14-20
    结果  20-28
  第二节 重组融合蛋白TAP-SSL5 的表达与纯化  28-37
    材料与试剂  28-31
    方法  31-34
    结果  34-37
  讨论  37-38
  小结  38-39
第二部分 重组融合蛋白TAP-SSL5 的抗炎和抗凝功能研究  39-67
  第一节 重组融合蛋白TAP-SSL5 的体外功能实验研究  39-50
    材料与试剂  39-41
    方法  41-45
    结果  45-49
    讨论  49-50
  第二节 重组融合蛋白TAP-SSL5 在体功能实验研究  50-66
    试剂与材料  50-53
    方法  53-57
    结果  57-64
    讨论  64-66
  小结  66-67
全文总结  67-68
致谢  68-69
附图  69-70
参考文献  70-76
文献综述 炎症机制在动脉粥样硬化病变形成中的作用  76-87
  参考文献  81-87
研究生期间发表的论文或会议论文目录  87

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 血管疾病 > 动脉疾病
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