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低温诱导烟草早花研究与烟草MADS-box基因的同源克隆

作　者: 李元元
导　师: 王元英
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 烟草低温诱导早花 MADS-box基因家族基因表达
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

烟草是一种重要的叶用经济作物,在烟叶种植过程中易出现早花现象,烟草早花严重影响烟叶产量和质量。低温是诱导烟草早花的重要因素之一,到目前为止,其相关的早花规律研究结果意见不一,其分子机制也一直不清楚。本研究利用低温敏感的烤烟品种NC82,通过不同苗期的低温诱导处理(12℃10 d ),研究该品种在不同苗期对低温的敏感特性;与此同时,采用RT-PCR和RACE等同源克隆技术对NC82中与开花相关的MADS-box家族基因进行同源克隆,并采用半定量RT-PCR和Real-Time PCR技术对克隆得到的基因进行表达分析。该研究具有现实的生产指导意义,也为培育低温不敏感烤烟品种提供很好的功能基因。具体研究结果如下:(1)NC82的低温诱导结果:移栽后第16 d,8叶期低温处理的烟苗首先出现花芽分化迹象,开始由营养生长向生殖生长转变;移栽后第21 d,6叶期和8叶期低温处理的烟苗均出现花芽分化,其对照均在移栽后第26 d左右才出现花芽分化,低温处理分别使其花芽分化提前5 d和8 d;移栽后第31d,6叶期和8叶期低温处理的烟苗提前现蕾,其对照在移栽第36 d左右才现蕾;低温处理和对照烟苗的中心花开放时间相差2～3 d,均在移栽后的第45～49 d; 4叶期低温处理的烟苗则相反,其花芽分化、现蕾和中心花开放分别比对照晚11d、18 d和16 d。所以6叶期和8叶期是NC82低温敏感期,低温能促进早花,但4叶期易受低温伤害,延迟开花;低温处理烟苗的花芽分化到现蕾时间比对照时间长,说明低温延长了花原基的分化过程;而现蕾到开花的天数波动很大,可能受环境影响很大。(2)烟草MADS-box基因家族中间片段克隆:通过设计简并引物,采用RT-PCR技术从NC82茎尖中成功分离出27条cDNA片段,长度在122～146 bp之间。序列分析表明,其中有16条具有MADS_MEF2类保守结构域,与拟南芥等MADS-box基因家族成员具有很高的同源性,相似性平均能达到76%,并具有15个保守的氨基酸位点,其中7个位点参与蛋白与DNA的相互作用,5个位点具有蛋白二聚化功能。系统发育分析发现这16条保守片段分别和拟南芥9个不同的MADS-box基因家族亚类最近似,其中FLC、STMADS11、TM3和AGL6亚家族具有控制开花时间的功能;AG、AGL2和DEF/GLO亚家族分别属于C/D型、E型和B型花器官同源异型基因;AGL15和AGL12亚家族的基因在茎中也可以表达。(3)烟草NtFLC的全长克隆及表达分析:利用与拟南芥AtFLC相似性最高的中间片段LyE05设计引物进行3’RACE和5’全长克隆,选取5’完整的片段A5(805 bp)和B1(433 bp),3’RACE的845 bp全长,以及中间保守序列LyE05 (146 bp)进行烟草FLC类基因的全长拼接,得到1174 bp的烟草FLC类全长cDNA。应用NCBI的ORF finder软件,发现其可读框架(ORF)位于172～786位核酸之间,长度615 bp,编码204个氨基酸,该蛋白属于MADS-box基因家族,并含有保守的MADS-box和K-box结构域;系统发育树分析发现其与拟南芥AtFLC具有同源性;半定量RT-PCR的表达分析发现NtFLC主要在茎和茎尖中表达,在花和果实中表达量很少;Real-Time PCR进行准确定量分析表明NtFLC的表达量在低温处理后的茎尖中是降低的。所以推测NtFLC可能与NC82低温敏感,易早花特性相关,在烟草中具有与拟南芥AtFLC相近的功能。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章文献综述  12-26
  1.1 烟草概况  12-13
    1.1.1 烟草属的分类和起源  12
    1.1.2 烟草的产量和品质  12
    1.1.3 打顶抹芽  12-13
  1.2 烟草早花  13-14
    1.2.1 烟草早花的概念  13
    1.2.2 烟草早花的成因  13-14
  1.3 植物MADS-BOX 基因家族概况  14-19
    1.3.1 MADS-box 基因的由来  14
    1.3.2 MADS-box 基因的主要作用  14
    1.3.3 MADS-box 基因的类型和结构  14-15
    1.3.4 MADS-box 不同亚家族成员及功能  15-19
  1.4 MADS-BOX 基因控制植物开花的分子机理  19-24
    1.4.1 拟南芥开花时间的调节  20-21
    1.4.2 禾本科植物开花时间的调节  21-23
    1.4.3 单子叶和双子叶植物开花时间调节机理的比较  23-24
  1.5 本研究的目的意义、研究内容与技术路线  24-26
    1.5.1 研究的目的意义  24
    1.5.2 研究的主要内容  24
    1.5.3 研究的技术路线  24-26
第二章低温处理下的烤烟NC82 早花规律研究  26-30
  2.1 材料与方法  26-27
    2.1.1 实验材料及实验地点  26
    2.1.2 实验材料的低温处理  26
    2.1.3 茎顶端分生组织的观察  26
    2.1.4 生物学性状的调查  26-27
  2.2 结果与分析  27-29
    2.2.1 低温处理对NC82 花芽分化进程的影响  27
    2.2.2 低温处理对NC82 现蕾和中心花开放的影响  27-28
    2.2.3 低温处理对NC82 发育进程的影响  28-29
    2.2.4 低温处理对NC82 有效叶数的影响  29
  2.3 讨论  29-30
第三章烟草MADS-BOX 基因家族保守片段的克隆与序列分析  30-37
  3.1 材料与方法  30-32
    3.1.1 实验材料  30
    3.1.2 茎尖总RNA 提取  30
    3.1.3 RT-PCR 扩增中间片段  30-32
    3.1.4 中间片段的回收和鉴定  32
    3.1.5 中间片段的序列分析  32
  3.2 结果与分析  32-36
    3.2.1 RNA 提取结果  32-33
    3.2.2 烟草MADS-box 基因中间片段鉴定  33-34
    3.2.3 烟草MADS-box 基因中间片段的序列分析  34-36
  3.3 讨论  36-37
第四章烟草FLC 类MADS-BOX 基因的全长克隆  37-49
  4.1 材料与方法  37-43
    4.1.1 实验材料  37
    4.1.2 烟草FLC 类基因的3’RACE 克隆  37-41
    4.1.3 烟草FLC 类基因的5’全长克隆  41-42
    4.1.4 烟草FLC 类基因的全长拼接  42-43
  4.2 结果与分析  43-48
    4.2.1 烟草FLC 类基因3’RACE 克隆结果  43-44
    4.2.2 烟草FLC 类基因5’全长克隆结果  44-45
    4.2.3 烟草FLC 类基因全长拼接及序列分析  45-48
  4.3 讨论  48-49
第五章烟草NTFLC 基因的表达分析  49-59
  5.1 材料、试剂和仪器  49
    5.1.1 实验材料  49
    5.1.2 药品和试剂  49
    5.1.3 实验仪器与设备  49
  5.2 实验方法与步骤  49-53
    5.2.1 半定量RT-PCR  49-52
    5.2.2 荧光定量PCR  52-53
  5.3 结果与分析  53-57
    5.3.1 目的基因NtFLC 在不同组织间检测结果  53-54
    5.3.2 目的基因NtFLC 低温处理前后的表达结果  54-57
  5.4 讨论  57-59
第五章全文结论  59-60
参考文献  60-66
附录  66-69
致谢  69-70
作者简历  70

低温诱导烟草早花研究与烟草MADS-box基因的同源克隆

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