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日本血吸虫中国大陆株性别差异表达基因的研究

作　者: 金亚美
导　师: 蔡幼民
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本血吸虫 2-D电泳性别差异抱雌沟蛋白基因卵壳前体蛋白基因 21.7Kd蛋白基因
分类号: S852.735
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

血吸虫病世界性分布，危害严重，为人畜共患的重大疾病之一。雌雄合抱是血吸虫发育、成熟、产卵的前提，而虫卵是造成病理损害和病原传播的关键。本文针对在我国流行的日本血吸虫中国大陆株开展性别差异表达基因等研究，以深入探索血吸虫发育及生殖机理、开拓免疫预防新途径。本研究利用双向电泳和质谱技术测定了2种血吸虫雄虫和一种血吸虫雌虫性别差异表达蛋白质的肽质量指纹图谱，并利用生物信息学方法对血吸虫蛋白质进行了初步分析，为进一步利用蛋白质组学方法寻找性别差异表达蛋白质及其相应基因提供了基础。本研究应用RT-PCR方法和5’RACE技术，首次克隆得到日本血吸虫抱雌沟蛋白的完整编码基因SjGcp，已申报发明专利(申请号：02110673.8；GeneBank登录号：AF519183)。同源性分析提示该蛋白质可能具有发育调节功能。Western印迹分析结果说明该基因在大肠杆菌中的融合表达产物rSjGcp具有良好的抗原性。攻击保护实验显示与保守区相比，血吸虫抱雌沟蛋白全长具更强的免疫保护功能、尤其对减少宿主肝脏卵负荷表现更好效果，有重要意义。对血吸虫卵壳蛋白的研究有助于阐明雌虫发育机制和研制抗卵胚发育的药物和疫苗。本研究利用RT-PCR、5’RACE和3’RACE技术首次克隆得到日本血吸虫卵壳前体蛋白基因(Sj423)的完整cDNA(GeneBank登录号：D32205)。同源性分析表明该基因编码蛋白质可能具有肝片吸虫卵壳前体蛋白相似的性质和功能。通过从血吸虫基因组DNA中克隆该基因并进行测序分析发现该基因同其他血吸虫卵壳蛋白基因一样没有内含子，这可能有利于卵壳前体蛋白的迅速和大量形成。Western印迹分析结果说明该基因在大肠杆菌中的融合表达产物rSj423具有良好的抗原性。为查明SjGcp和Sj423基因表达的性别和时相差异，通过Southern blot和Northern blot进行了检测。结果表明SjGcp基因为雄虫特异性表达基因，在尾蚴感染后第14天即雌雄虫将合抱前的雄虫体内可见转录表达；Sj423基因为雌虫特异性表达基因，在尾蚴感染后第11天即雌雄合抱前更早阶段的雌虫体内已见转录博士学位论文摘要中国农业科学院表达，显示了血吸虫发育、生殖及其调控机制的复杂性和多样性。另外，近有研究结果显示IgE抗体在血吸虫病的保护性免疫中起着重要作用，日本血吸虫菲律宾株一诱导该抗体的抗原编码基因（Sip21．7）己被克隆。我们采用 RTPCR方法克隆得到日本血吸虫中国大陆株的相应基因 SjCZI．7。软件分析结果提示其可能与血吸虫的膜相关蛋白及肝片吸虫的钙结合蛋白有相似的结构和功能，并利用软件对该蛋白质的结构和功能域进行了预测，表明其具有作为血吸虫候选疫苗抗原的发展潜能。Western印迹分析结果说明该基因在大肠杆菌中的融合表达产物 rsjcZI．7具有良好的抗原性。总之，本研究利用双向电泳、质谱结合生物信息学技术对日本血吸虫雌雄蛋白质差异进行了初步分析和探索，首次克隆了日本血吸虫中国大陆株性别差异表达基因SjGCp和Sj423及在血吸虫病免疫保护中起重要作用的抗原基因SjCZI．7，并对其抗原性、SjGCp和 Sj423基因的表达差异性及 SjGCp基因在大肠杆菌中融合表达产物的免疫保护功能进行了研究。本项研究为进一步阐明血吸虫性别发育。生殖机制，提供了一定的理论基础，对开发血吸虫病疫苗候选抗原基因和研制新药物，具有重要意义。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-11
引言部分  11-25
  一血吸虫概述  11-14
    1．血吸虫的发现  11
    2．血吸虫分类  11-12
    3．血吸虫的生活史  12
    4．血吸虫的基因组结构  12-13
    5．我国血吸虫病概况  13
    6．血吸虫病免疫预防的战略意义  13-14
  二血吸虫性别差异基因及其表达调控的研究进展  14-23
    1．与合抱有关的性别差异表达物质及信息传递物质的研究  14-17
      1．1 GCP（抱雌沟蛋白）基因  15
      1．2 信息传递物质Ras、GAP和MAP激酶的探索  15-16
      1．3 其它  16-17
    2．与卵形成有关的功能基因及其发育调控研究  17-23
      2．1 血吸虫卵壳蛋白基因的研究  17-22
        （1）曼氏血吸虫卵壳蛋白基因的研究  17-19
        （2）日本血吸虫卵壳蛋白基因的研究  19-20
        （3）埃及血吸虫卵壳蛋白基因的研究  20-21
        （4）不同种类血吸虫卵壳蛋白基因表达调控的类似结构特点  21-22
      2．2 与卵形成及产生有关的其它功能基因的研究  22-23
  三深入开展虫体性别差异表达基因的研究，开拓免疫预防的新途  23-25
实验部分  25-96
  第一篇日本血吸虫性别差异表达蛋白的研究  25-35
    前言  25-26
    材料  26-29
    方法  29-30
    结果  30-33
    讨论  33-35
  第二篇日本血吸虫抱雌沟蛋白全长编码基因的研究  35-70
    前言  36-37
    第一章日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白编码基因的克隆和表达  37-59
      材料  37-41
      方法  41-50
      结果  50-59
    第二章日本血吸虫编码抱雌沟蛋白基因的性别、时相表达差异性  59-65
      材料  59-60
      方法  60-63
      结果  63-65
    第三章 SjGCP表达产物免疫保护功能的研究  65-68
      材料  65
      方法  65-67
      结果  67-68
    第四章小结与讨论  68-70
  第三篇血吸虫Sj423卵壳前体蛋白编码基因的克隆及其转录差异性研究  70-85
    前言  70-71
    第一章日本血吸虫Sj423 卵壳前体蛋白全长编码基因的克隆和表达  71-79
      材料  72-73
      方法  73-75
      结果  75-79
    第二章日本血吸虫Sj423卵壳前体蛋白基因的性别、时相表达差异性  79-82
      材料  79-80
      方法  80
      结果  80-82
    第三章 Sj423基因无内含子的鉴定  82-83
      材料  82
      方法  82-83
      结果  83
    第四章小结与讨论  83-85
  第四篇日本血吸虫21．7Kd抗原编码基因的克隆表达  85-96
    前言  85-86
    材料  86
    方法  86-87
    结果  87-93
    讨论  93-96
结论  96-97
参考文献  97-106
致谢  106-107
作者简历  107

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