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单增李斯特菌在肉牛屠宰过程中的流行特点及其热失活模型的建立

作　者: 冯晓慧
导　师: 朱立贤；罗欣
学　校: 山东农业大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 牛肉单增李斯特菌血清型耐药性 RAPD分型热失活模型
分类号: R155.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 74次
引　用: 1次
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内容摘要

单增李斯特菌(L.monocytogenes, Lm)是李斯特菌属(Listeria)中的一种,是一种人畜共患致病菌,也是重要的食源性致病菌之一。牛肉污染单增李斯特菌会导致严峻的食品安全问题,严重威胁人类健康。本文主要研究了肉牛屠宰过程中单增李斯特菌的流行分布特点,同时对分离到的菌株进行药物敏感性试验,分析其耐药情况,研究其血清型、主要毒力基因和分子分型,通过表型和基因型分析,明确不同来源菌株的亲缘关系。本课题的研究可为单增李斯特菌的源头防控提供解决思路,为保证我国分割牛肉安全奠定基础。本文的研究内容分三部分。1.肉牛屠宰过程中单增李斯特菌污染特点的研究本文对山东省内三个肉牛屠宰厂(A、B、C厂)牛肉生产过程中单增李斯特菌的流行特点进行调查研究,采样环节主要包括牛的粪便、皮毛、去皮后躯体、去内脏后胴体、喷淋后胴体、冷却后胴体和分割肉7个环节。依据ISO11290-1方法,对单增李斯特菌分离鉴定,3个肉牛屠宰厂共收集439份样品,其中288个样品中检出李斯特菌,检出率为65.6%;116个样品中检出单增李斯特菌,检出率为26.4%;B厂的检出率占总检出率的94.8%。2.不同厂、不同环节单增李斯特菌分离株的表型及基因型研究采用多重PCR法对分离菌株进行血清型分析,药物敏感性试验采用Kirby-Bauer方法,通过PCR法研究不同来源单增李斯特菌主要毒力基因prfA、plcA、hlyA、actA、iap的携带情况,采用RAPD法进行分子分型的研究。来源于3个厂的单增李斯特菌分为两个血清型,C厂为1/2a,A、B两厂均为1/2c,不同屠宰厂来源的单增李斯特菌的血清型有明显的地区差异。随机抽取55株单增李斯特菌分离株进行药敏试验,它们对青霉素G、诺氟沙星、复方新诺明等敏感,对头孢噻吩的耐药率为1.82%,对多粘菌素B、头孢噻肟、依诺沙星的耐药率分别为25.5%、36.4%、38.2%,同时存在不同程度的多重耐药情况。单增李斯特菌的毒力基因存在不同程度的缺失,从总体来看,55株单增李斯特菌中缺失毒力基因的有3株,其中hly、iap和prfA基因均全被检出;actA基因有2株未检出;plcA基因有1株未检出。55株单增李斯特菌可分为34种不同的RAPD型别。3.牛肉中单增李斯特菌热失活模型的建立在微生物杀菌研究中,建立微生物预测模型能够减少或替代为确保食品安全而进行的常规试验,已经获得了越来越广泛的应用。为了建立牛肉中单增李斯特菌的热失活动力学模型,将接种了3种不同血清型的单增李斯特菌混合菌液的牛肉分别在55℃、57.5℃、60℃、63℃、66℃和70℃进行热处理,在不同温度条件下单增李斯特菌数从109CFU?g-1下降至103CFU?g-1,其热失活曲线分别用Linear模型和修正的Gompertz模型进行了拟合。随着加热温度的升高,单增李斯特菌在牛肉中的灭活速率逐渐增大,D值逐渐减小,Z值为6.25℃。修正的Gompertz模型拟合牛肉中单增李斯特菌的失活曲线优于Linear模型。建立了温度对修正的Gompertz模型参数影响的二级模型,即lnM=27.516-0.364T;lnμ=-27.358+0.366T。用59℃和64℃下实际的单增李斯特菌存活数对所建的两种模型进行验证,修正的Gompertz模型偏差度(Bf)和准确度(Af)在可接受范围,且修正的Gompertz模型的RMSE值极显著低于Linear模型,表明修正的Gompertz模型比Linear模型能更好的预测热处理对单增李斯特菌的影响。本研究所建立的Gompertz模型能较好的模拟不同温度(55-70℃)对牛肉中单增李斯特菌热失活的影响。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
1 前言  11-22
  1.1 冷却肉中的微生物  11
  1.2 单增李斯特菌的研究概况  11-13
    1.2.1 单增李斯特菌的生长特性  11-12
    1.2.2 单增李斯特菌在肉品生产过程中的污染情况  12-13
  1.3 单增李斯特菌的主要毒力因子及其致病机理  13-16
    1.3.1 hly 基因（李斯特菌溶血素O 基因）  13-14
    1.3.2 plcA 和plcB（磷酸酯酶C 基因）  14
    1.3.3 actA 基因  14-15
    1.3.4 inlA 和inlB 基因  15-16
    1.3.5 iap 基因  16
    1.3.6 prfA 基因  16
  1.4 单增李斯特菌的分型技术  16-18
    1.4.1 单增李斯特菌的血清学分型（serotyping）  17
    1.4.2 单增李斯特菌的RAPD 分型  17-18
  1.5 预测微生物学的概述及应用  18-21
    1.5.1 预测微生物学概述  18-19
    1.5.2 预测微生物模型的分类  19-20
    1.5.3 单增李斯特菌在预测微生物学方面的研究  20-21
  1.6 本课题的研究目的与意义  21-22
  1.7 本课题的主要研究内容  22
2 材料与方法  22-31
  2.1 材料  22
  2.2 主要试剂  22-24
  2.3 主要仪器与设备  24
  2.4 试验方法  24-31
    2.4.1 肉牛屠宰过程中单增李斯特菌的检测  24-25
    2.4.2 单增李斯特菌耐药性分析  25-26
    2.4.3 单增李斯特菌的血清学分型  26-27
    2.4.4 单增李斯特菌毒力基因的检测  27-28
    2.4.5 单增李斯特菌RAPD 分子分型  28
    2.4.6 牛肉中单增李斯特菌热失活模型的建立  28-31
3 结果与分析  31-46
  3.1 肉牛屠宰过程中李斯特菌和单增李斯特菌的检出率  31-33
  3.2 单增李斯特菌的耐药性分析  33-34
  3.3 单增李斯特菌的血清学分型  34-36
  3.4 单增李斯特菌毒力基因的检测  36-38
  3.5 单增李斯特菌的RAPD 分子分型  38-41
  3.6 牛肉中单增李斯特菌热失活模型的建立  41-46
    3.6.2 恒温单增李斯特菌的一级热失活模型建立  41-44
    3.6.3 单增李斯特菌二级模型的建立  44-45
    3.6.4 单增李斯特菌热失活模型的验证  45-46
4 讨论  46-53
  4.1 肉牛屠宰过程中单增李斯特菌的污染特点  46-48
  4.2 单增李斯特菌的耐药性分析  48-49
  4.3 单增李斯特菌的血清学分型  49
  4.4 单增李斯特菌的毒力基因  49-50
  4.5 单增李斯特菌的RAPD 分子分型  50-51
  4.6 牛肉中单增李斯特菌的热失活模型  51-53
5 结论  53-55
6 创新点  55-56
7 参考文献  56-72
8 致谢  72-73
9 攻读学位期间发表论文情况  73

单增李斯特菌在肉牛屠宰过程中的流行特点及其热失活模型的建立

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