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副猪嗜血杆菌流行病学研究及疫苗候选株的筛选

作　者: 樊祜卿
导　师: 伏小平；逯忠新
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医
关键词: 副猪嗜血杆菌分离鉴定血清型 PCR-RFLP 制苗菌株筛选
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属成员,是猪Gl?sser,s病(副猪嗜血杆菌病)的病原菌。副猪嗜血杆菌病以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎、高热及高死亡率为特征。随着世界养猪业的发展,该病已经成为全球范围内影响养猪业的一种重要疾病。通过对2007年至2009年从全国7个省份采集的疑似副猪嗜血杆菌病猪进行HPS分离,经细菌形态、培养特性、生化特性及PCR鉴定,成功分离鉴定出了52株HPS分离株。通过琼脂扩散试验(Gel diffusion,GD)和间接血凝试验(Indirect haemagglutination,IHA)对分离株进行了血清学分型,结果显示血清4型11株、5型13株、12型9株、13型8株、14型3株、3型3株、10型1株,分型率达到了92.3%,另有4株无法进行血清学分型。该实验结果表明我国流行的HPS优势血清型为4型、5型、12型和13型,为我国副猪嗜血杆菌病的防控提供了科学的理论依据。利用转铁蛋白tbpA基因PCR-RFLP分型方法对52株HPS分离株及15个标准株进行PCR-RFLP分析,该方法可将15个血清型标准株分为13个RFLP基因型,52个HPS分离株可全部分型,共分为13个RFLP基因型,相同血清型菌株具有不同的基因型,我国最为流行的基因型为DBN(34.6%)和ABN(23.1%)。结果提示PCR-RFLP方法具有较好的敏感性和分型率,HPS具有广泛的遗传多样性,丰富了我国现阶段HPS的流行病学资料。通过豚鼠感染试验和仔猪感染试验筛选出了我国流行优势血清型HPS毒力较强的菌株hps0910(4型)、hps0814(5型)和hps0709(12型),并测定了其免疫原性。结果显示hps0910、hps0814和hps0709对相应菌株的保护率分别达到了5/6、5/6和6/6,表明hps0910(4型)、hps0814(5型)和hps0709(12型)可以作为HPS疫苗候选菌株,为下一步HPS三价灭活疫苗的研制奠定了基础。

全文目录

摘要  2-3
Summary  3-8
缩略词(Abbrevintion)  8-9
第一部分文献综述  9-17
  第一章研究进展  9-17
    1.1 病原学研究进展  9-10
    1.2 流行病学研究进展  10
    1.3 感染动物模型研究进展  10-11
    1.4 分型方法研究进展  11-14
      1.4.1 血清学分型  11-12
      1.4.2 基因分型方法  12-14
    1.5 致病机理研究  14-16
    1.6 防治  16-17
第二部分研究报告  17-46
  第二章副猪嗜血杆菌的分离鉴定  17-23
    2.1 材料  17-19
      2.1.1 样品来源  17
      2.1.2 菌种  17
      2.1.3 主要试剂  17-18
      2.1.4 主要溶液的配制  18
      2.1.5 主要培养基的制备  18-19
    2.2 方法  19-20
      2.2.1 HPS 的分离  19
      2.2.2 革兰氏染色镜检  19
      2.2.3 生化鉴定  19
      2.2.4 PCR 检测  19
      2.2.5 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测  19-20
    2.3 结果  20-21
      2.3.1 菌落特征与细菌形态  20
      2.3.2 生化鉴定  20-21
      2.3.3 PCR 鉴定  21
    2.4 讨论  21-23
  第三章副猪嗜血杆菌的血清学分型  23-29
    3.1 材料  23
      3.1.1 实验动物  23
      3.1.2 主要溶液的配制  23
    3.2 方法  23-26
      3.2.1 标准阳性血清的制备  23-24
      3.2.2 分离株分型用抗原的制备  24
      3.2.3 标准阴性血清  24
      3.2.4 琼脂扩散试验  24-25
      3.2.5 间接血凝试验  25-26
    3.3 结果  26-27
    3.4 讨论  27-29
  第四章副猪嗜血杆菌tbpA 基因的PCR-RFLP 分析  29-36
    4.1 材料与方法  29-31
      4.1.1 菌种  29
      4.1.2 培养基  29-30
      4.1.3 主要试剂和酶  30
      4.1.4 tbpA 基因的PCR 扩增  30-31
    4.2 结果  31-34
      4.2.1 HPS 标准株tbpA 基因PCR 扩增结果  31
      4.2.2 HPS 标准株RFLP 分析  31
      4.2.3 HPS 分离株RFLP 分析  31-34
    4.3 讨论  34-36
  第五章副猪嗜血杆菌强毒菌株的筛选  36-42
    5.1 材料与方法  36-38
      5.1.1 培养基  36
      5.1.2 菌种  36
      5.1.3 实验动物  36
      5.1.4 平板菌落计数  36-37
      5.1.5 人工感染豚鼠  37
      5.1.6 豚鼠感染试验临床和剖检观察  37
      5.1.7 细菌学检查  37
      5.1.8 人工感染仔猪  37
      5.1.9 仔猪感染实验临床和剖检观察  37-38
    5.2 结果  38-40
      5.2.1 人工感染豚鼠试验  38
      5.2.2 感染豚鼠试验临床症状和剖检变化  38
      5.2.3 病原菌的分离鉴定  38-39
      5.2.4 人工感染仔猪试验  39
      5.2.5 感染仔猪试验临床症状和剖检变化  39-40
    5.3 讨论  40-42
  第六章副猪嗜血杆菌分离株的免疫原性试验  42-45
    6.1 材料  42
      6.1.1 菌种  42
      6.1.2 实验动物  42
      6.1.3 主要试剂  42
    6.2 方法  42-43
      6.2.1 培养基的制备  42-43
      6.2.2 平板菌落计数  43
      6.2.3 疫苗的制备  43
      6.2.4 免疫原性试验  43
    6.3 结果  43-44
    6.4 讨论  44-45
  第七章结论  45-46
参考文献  46-53
致谢  53-54
导师简介  54-55
作者简介  55-56

副猪嗜血杆菌流行病学研究及疫苗候选株的筛选

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