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玉米干旱诱导型基因启动子的克隆及功能分析

作　者: 胡瑞学
导　师: 潘洪玉
学　校: 吉林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 玉米 诱导型启动子 植物表达载体 瞬时表达 荧光定量
分类号: S513
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


干旱生态危机已经严重影响到人类的可持续发展,因此在农业开发中,急需耐旱、水分胁迫环境下能生长的粮食作物和植被。高等植物基因的表达调控已经成为分子生物学研究领域的热点和前言,启动子是基因表达调控的重要元件。深入研究启动子的结构和功能,建立可用于植物转基因表达的时、空、量三维调控系统,可为功能基因组学研究及通过基因工程技术精确地调节植物代谢提供全新的思路。由于组成型启动子不加控制的大量表达外源基因,不能从时间和空间上有效调控目的基因的表达。因此对有诱导型、组织特异性启动子的研究和利用就显得尤为重要。玉米是我国重要的粮食作物,干旱胁迫是影响玉米产量的重要因素之一,然而目前关于玉米干旱诱导型启动子的研究较少。本实验对玉米干旱诱导型基因ZmCIPK1、ZmLOC1启动子的研究获得了如下结论:1.在NCBI网站中查找干旱诱导型基因ZmCIPK1和ZmLOC1,并对这两个基因的5’段通过生物信息学的方法进行分析。发现启动子序列存在典型的TATA-box,以及CAAT-box,符合真核生物启动子的基本特征。同时发现了干旱诱导的顺式作用元件,MYB识别位点、MYC识别位点,以及一些与盐诱导低温诱导有关的元件。预测这两个启动子具有干旱诱导的特性。2.将启动子PZmCIPK1(2002bp)、PZmLOC1(1964bp)片段构建植物表达载体pCAM∷PZmCIPK1、pCAM∷PZmLOC1,通过农杆菌介导的方法转化玉米幼胚,烟草愈伤组织。采用GUS组织化学染色的方法对GUS基因的瞬时表达进行分析,发现启动子PZmCIPK1经过干旱诱导后,活性明显增强,而启动子PZmLOC1的干旱诱导活性不是很明显。3.用叶盘转化法获得转基因烟草,并用GUS组织化学染色的方法分析了GUS基因的稳定表达。结果表明启动子PZmCIPK1、PZmLOC1在转基因烟草中能够稳定表达,转基因烟草经过干旱诱导后,启动活性明显增强。4.为了研究启动子PZmCIPK1、PZmLOC1的组织表达方式和主要调控区域,对启动子进行5’段缺失分析,分别构建植物表达载体pCAM∷PZmCIPK2、pCAM∷PZmCIPK3、pCAM∷PZmCIPK4、pCAM∷PZmCIPK5以及pCAM∷PZmLOC2、pCAM∷PZmLOC3、pCAM∷PZmLOC4、pCAM∷PZmLOC5。荧光定量检测表明启动子PZmCIPK1活性最强的区段为PZmCIPK5,启动子PZmLOC1活性最强的区段为PZmLOC5。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章 文献综述  10-31
  1 干旱对我国农业的影响  10
  2 干旱对植物的影响  10-11
  3 植物启动子的核心结构及其功能  11-14
    3.1 转录起始位点  11-12
    3.2 TATA-box  12
    3.3 CAAT-box  12
    3.4 GC-box  12-13
    3.5 起始因子  13
    3.6 增强子  13
    3.7 主要逆境相关顺式作用元件  13-14
  4 植物启动子的类型  14-26
    4.1 组成型启动子  14-16
      4.1.1 CaMV355 启动子  14-15
      4.1.2 Act1 启动子  15
      4.1.3 Ubiquitin 启动子  15-16
    4.2 诱导型启动子  16-23
      4.2.1 干旱诱导启动子  17-18
      4.2.2 盐诱导启动子  18-19
      4.2.3 低温诱导启动子  19-20
      4.2.4 光诱导启动子  20
      4.2.5 植物激素诱导启动子  20-22
      4.2.6 重金属诱导型启动子  22
      4.2.7 病原微生物诱导表达的启动子  22-23
      4.2.8 损伤诱导型启动子  23
    4.3 组织特异性启动子  23-26
      4.3.1 根特异性启动子  24
      4.3.2 韧皮部和维管束特异性启动子  24-25
      4.3.3 叶片表达启动子  25
      4.3.4 胚乳组织特异表达启动子  25-26
      4.3.5 果实特异性启动子  26
  5 植物启动子的主要克隆方法  26-28
    5.1 利用基因组文库筛选启动子  26
    5.2 启动子探针质粒载体筛选启动子  26-27
    5.3 利用PCR 技术克隆启动子  27-28
      5.3.1 普通PCR 技术  27
      5.3.2 反向PCR 技术  27
      5.3.3 交错式热不对称PCR  27
      5.3.4 接头PCR  27-28
  6 启动子研究主要方法  28-29
  7 本研究的目的和意义  29-31
第二章 玉米抗旱基因ZmCIPK 及ZmLOC 启动子的克隆及序列分析  31-48
  1 材料  31-33
    1.1 植物材料与宿主菌  31-32
    1.2 工具酶及试剂  32
    1.3 主要仪器设备  32
    1.4 主要试剂的配制及培养基  32-33
  2. 方法  33-37
    2.1 干旱诱导型基因启动子序列的获得  33
    2.2 引物的设计与合成  33
    2.3 采用CTAB 法提取玉米叶片基因组DNA  33-34
    2.4 PCR 扩增启动子序列  34
    2.5 PCR 产物回收  34-35
    2.6 大肠杆菌DH5α热击感受态细胞的制备  35
    2.7 回收产物与pMD18-T 克隆载体连接  35-36
    2.8 连接产物的转化  36
    2.9 重组质粒的提取  36-37
    2.10 重组质粒的酶切鉴定  37
    2.11 启动子序列分析  37
  3 结果与分析  37-46
    3.1 PZm CIPK 启动子序列的克隆及序列分析  37-42
      3.1.1 PZmCIPK 启动子序列的克隆  37-40
      3.1.2 PZmCIPK 启动子序列的分析  40-42
    3.2 PZmLOC 启动子序列的克隆及序列分析  42-46
      3.2.1 PZmLOC 启动子序列的克隆  42-44
      3.2.2 PZmLOC 启动子序列的分析  44-46
  4 结论与讨论  46-48
第三章 启动子PZmLOC、PZmCIPK 植物表达载体的构建及农杆菌的转化  48-53
  1 材料  48
  2 方法  48-50
    2.1 植物表达载体构建  48-49
    2.2 表达载体转化农杆菌及鉴定  49-50
      2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备  49
      2.2.3 筛选与鉴定  49-50
  3 结果与分析  50-52
    3.1 植物表达载体的构建  50-51
    3.2 植物表达载体转化农杆菌  51-52
  4 结论与讨论  52-53
第四章 GUS 报告基因的瞬时表达分析  53-56
  1 材料  53
    1.1 试剂与植物材料  53
    1.2 主要仪器设备  53
    1.3 主要试剂的配制  53
  2 方法  53-54
    2.1 农杆菌介导侵染玉米  53-54
    2.2 GUS 组织化学染色分析  54
  3 结果与分析  54-55
  4 结论与讨论  55-56
第五章 通过渐变缺失分析启动子核心序列  56-65
  1. 材料  56
    1.1 试剂  56
    1.2 主要仪器设备  56
    1.3 主要试剂的配制  56
  2 方法  56-60
    2.1 启动子缺失片段的获得及缺失表达载体的构建  56-58
    2.2 GUS 荧光定量分析  58-60
      2.2.1 GUS 酶提取  58-59
      2.2.2 GUS 提取液的蛋白含量测定  59
      2.2.3 荧光测定  59-60
      2.2.4 GUS 酶活性计算  60
  3 结果与分析  60-63
    3.1 PZm CIPK 启动子缺失片段的获得及缺失表达载体的构建  60-61
    3.2 PZmLOC 启动子缺失片段的获得及缺失表达载体的构建  61-62
    3.3 GUS 荧光定量分析  62-63
  4 结论与讨论  63-65
第六章 烟草遗传转化及转基因植株的检测  65-72
  1 材料  65-66
    1.1 植物材料  65
    1.2 试剂  65
    1.3 主要仪器设备  65
    1.4 主要试剂的配制  65-66
  2 方法  66-67
    2.1 受体材料的制备  66
    2.2 农杆菌的扩大培养  66
    2.3 农杆菌介导的遗传转化及植株的再生  66-67
    2.4 转基因烟草的鉴定  67
    2.5 GUS 活性的组织化学染色  67
  3 结果与分析  67-70
    3.1 烟草植株的再生  67-68
    3.2 烟草愈伤组织的GUS 化学染色  68-69
    3.3 转基因烟草的PCR 检测  69
    3.4 GUS 活性的组织化学染色  69-70
  4. 结论与讨论  70-72
结论  72-73
参考文献  73-81
作者简介  81-82
致谢  82

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 玉米（玉蜀黍）
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