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小麦条锈菌PsMAPK1,PsCdc2,PsFuz7基因的克隆及PsMAPK1基因功能验证

作 者: 代西维
导 师: 康振生
学 校: 西北农林科技大学
专 业: 植物病理学
关键词: 细胞周期分裂基因 细胞周期蛋白依赖性激酶 催分裂原活化蛋白激酶 功能分析 实时荧光定量RT-PCR
分类号: S435.121
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


本论文研究了在小麦与条锈菌互作过程中,条锈菌催分裂原活化蛋白激酶基因PsMAPK1、细胞分裂周期基因PsCdc2及催分裂原活化蛋白激酶的激酶基因PsFuz7的转录表达情况;分析了PsMAPK1和PsFuz7基因在小麦条锈菌不同的生理小种中氨基酸序列的差异;另外,借助小麦赤霉病菌和稻瘟病菌突变体对PsMAPK1基因进行基因功能的验证。本论文首次从已构建的文库中筛选出小麦条锈菌催分裂原活化蛋白激酶基因PsMAPK1、细胞周期分裂基因PsCdc2和催分裂原活化蛋白激酶的激酶基因PsFuz7。分别克隆得到三个基因的cDNA和基因组DNA的全长,其中PsMAPK1基因组DNA全长2343bp,cDNA序列全长1834 bp,ORF编码408个氨基酸,由8个外显子和7个内含子组成;PsCdc2基因组DNA长2279bp ,cDNA序列全长1395 bp,编码294个氨基酸,由11个外显子和10个内含子组成;PsFuz7基因组DNA全长2661bp,cDNA序列全长2093 bp,编码419个氨基酸,含由8个外显子和7个内含子组成。定量表达分析表明,PsMAPK1在条锈菌侵染小麦前期呈上调表达,其中24h时表达量最高约为夏孢子中表达量的5.32倍,侵染36 h后表达量明显下降。PsCdc2在条锈菌夏孢子及病菌侵染后各个时间点均有表达,其中侵染12 h之前表达量称上升趋势,侵染12 h时表达量最高,约为夏孢子中表达量的1.62倍,侵染18 h之后表达量呈下降趋势,侵染36 h之后表达量均低于夏孢子中的表达量。PsFuz7在条锈菌侵染小麦后12 h前呈上调表达趋势,侵染后12 h时的表达量最高,约为夏孢子中表达量的1.95倍,侵染后6 h时表达量约为夏孢子中表达量的1.79倍,侵染18 h后表达量下降,表达量均低于夏孢子中的表达量。小麦条锈菌不同生理小种间序列分析发现,PsMAPK1和PsFuz7在条锈菌生理小种CYR23、CYR25、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33中均非常保守,核苷酸序列间无大的差异,PsMAPK1有9个氨基酸位点可能为易变位点,PsMAPK1有12个位点可能为易变位点。功能互补分析表明,PsMAPK1基因能够部分恢复小麦赤霉病菌△map1突变体的生长特性和致病性,能够部分恢复稻瘟菌突变体附着孢的形成和致病性,结合定量分析推测PsMAPK1基因具有与其他真菌MAPK基因功能上的一致性和保守性,为条锈病菌上一个致病相关基因。同时,通过对生物信息学分析及定量分析,推测PsFuz7、PsCdc2均为小麦条锈菌上重要的致病相关基因。PsFuz7可能通过催分裂原活化蛋白激酶级联反应,在将细胞外信号传递到细胞内,最终导致转录因子的激活从而调控致病性;而PsCdc2可能通过调节条锈菌的细胞周期,参与条锈菌侵染小麦前期菌丝的生长。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
第一章 文献综述  13-18
  1.1 小麦条锈病  13-14
    1.1.1 小麦条锈病的危害及分布  13
    1.1.2 小麦与条锈菌互作的研究  13-14
  1.2 蛋白激酶类基因的研究进展  14-17
    1.2.1 促分裂原细胞周期蛋白依赖性激酶类基因的研究进展  14-16
    1.2.2 细胞周期蛋白依赖性激酶基因的研究进展  16-17
  1.3 本论文的目的及意义  17-18
第二章 小麦条锈菌PsMAPK1 基因的克隆及功能验证  18-37
  2.1 材料及试剂  18
    2.1.1 材料  18
    2.1.2 试剂  18
  2.2 实验方法  18-26
    2.2.1 小麦条锈菌PsMAPK1 基因相关克隆菌株的查找  18
    2.2.2 质粒插入片断的鉴定  18-19
    2.2.3 测序鉴定  19-20
    2.2.4 小麦条锈菌PsMAPK1 基因序列分析  20
    2.2.5 总RNA 的提取与质量检测  20-21
    2.2.6 Real Time PCR 分析  21
    2.2.7 互补小麦赤霉病菌突变体Fg△map1 试验  21-23
    2.2.8 互补稻瘟菌突变体Mg△PMK1 试验  23-26
  2.3 结果与分析  26-37
    2.3.1 小麦条锈菌MAPK1 基因全长cDNA 及基因组DNA  26
    2.3.2 序列相似性和同源性搜索  26
    2.3.3 ORF 区的查找及氨基酸序列的推测  26-27
    2.3.4 氨基酸序列分析  27-29
    2.3.5 小麦条锈菌不同生理小种间PsMAPK1 蛋白序列分析  29
    2.3.6 Real time PCR 分析  29-32
    2.3.7 小麦赤霉菌△map1 突变体恢复试验  32-35
    2.3.8 小麦赤霉病菌接种小麦试验  35
    2.3.9 稻瘟菌△PMK1 突变体恢复附着孢试验  35
    2.3.10 接种大麦试验  35-37
第三章 小麦条锈菌PsCdc2 基因的克隆及转录表达分析  37-46
  3.1 材料及试剂  37
    3.1.1 材料  37
    3.1.2 试剂  37
  3.2 实验方法  37-38
    3.2.1 PsCdc2 的cDNA 序列与基因组序列的克隆  37
    3.2.2 总RNA 的提取与质量检测  37-38
    3.2.3 PsCdc2 编码蛋白的序列分析  38
    3.2.4 Real Time PCR 分析  38
  3.3 结果与分析  38-46
    3.3.1 小麦条锈菌Cdc2 基因全长cDNA 及基因组DNA  38-39
    3.3.2 相似性和同源性搜索  39
    3.3.3 ORF 查找及推测的氨基酸序列  39
    3.3.4 氨基酸序列分析和多肽跨膜区域  39-42
    3.3.5 多序列比对及进化树分析  42-44
    3.3.6 Real Time PCR 分析  44-46
第四章 小麦条锈菌 PsFuz7 基因的克隆及转录表达分析  46-54
  4.1 材料及试剂  46
    4.1.1 材料  46
    4.1.2 试剂  46
  4.2 实验方法  46-47
    4.2.1 PsFuz7 的cDNA 序列与基因组序列的克隆  46
    4.2.2 总RNA 的提取与质量检测  46
    4.2.3 小麦条锈菌不同生理小种中 Fuz7 基因 ORF 区的扩增  46-47
    4.2.4 小麦条锈菌不同生理小种中 Fuz7 基因 ORF 区序列的分析  47
    4.2.5 PsFuz7 编码蛋白的序列分析  47
    4.2.6 Real Time PCR 分析  47
  4.3 结果与分析  47-54
    4.3.1 小麦条锈菌 Fuz7 基因全长 cDNA 及基因组 DNA  47
    4.3.2 相似性和同源性搜索  47-48
    4.3.3 ORF 查找及推测的氨基酸序列  48-49
    4.3.4 氨基酸序列分析  49-50
    4.3.5 多序列比对及进化树构建  50-51
    4.3.6 Real time PCR 分析  51-54
第五章 结论与讨论  54-57
  5.1 催分裂原活化蛋白激酶PsMAPK1 基因  54-55
  5.2 细胞周期依赖性蛋白激酶PsCdc2 基因  55
  5.3 催分裂原活化蛋白激酶的激酶PsFuz7 基因  55-57
参考文献  57-61
附录  61-62
致谢  62-63
作者简介  63

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