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乙型脑炎病毒NS1蛋白单克隆抗体制备及其表位的鉴定

作　者: 刘立科
导　师: 任玉红
学　校: 河北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 乙型脑炎病毒 NS1蛋白单克隆抗体表位
分类号: R512.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一种以蚊虫为媒介传播的人和动物共患的病毒性疾病.乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）与西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）、圣路易脑炎病毒（Saint-Louis encephalitis virus,SLEV）和墨累河谷脑炎病毒（Murray Valley encephalitis virus,MVEV）同属一个血清群。上述病原可导致严重的公共卫生问题,而且其中的两种或多种病原往往在同一地区流行,加之它们在血清学上存在严重的交叉反应,所以建立起针对上述病原的快速、可靠的鉴别诊断方法十分必要。本研究以本实验室保存的SA14-14-2株NS1基因进行密码子优化后,由人工合成,将NS1基因分别亚克隆至原核表达载体pET-30和pMAL-c5X构建出重组质粒pET-30-opti-NS1和pc5X-opti-NS1。将pET-30-opti-NS1重组质粒验证连接正确后转化大肠杆菌感受态细胞BL21,经IPTG诱导表达后,将表达产物纯化作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠;经过免疫、融合、筛选等过程,共获得16株特异性针对NS1蛋白的单克隆抗体,IFA表明其中8株能识别天然状态下的NS1蛋白;将pc5X-opti-NS1重组质粒验证连接正确后转化大肠杆菌感受态细胞ER2523,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示重组的NS1蛋白在原核表达系统中得到大量表达,并部分以可溶形式存在。Western blot和间接ELISA检测表明该重组NS1蛋白能与猪JEV阳性血清发生特异性反应。以pc5X-opti-NS1表达的MBP-NS1蛋白为检测用抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。设计一套包含整个NS1蛋白的51个短肽片段,每个肽段长度为16aa,每两个相邻的短肽之间有8aa的重叠。为表达这些短肽,首先人工合成了表达它们的基因,在编码链的5’端引入BamHI位点,3’端引入XhoI位点。这51个肽段经IPTG诱导后得到了表达,表达产物与制备的单克隆抗体100816-10F7、100816-8B5、100910-1E8、100816-7G1、100816-4E3、100910-6D8作用,ELISA结果与单抗100816-10F7、100816-8B5、100910-1E8、100816-7G1、100816-4E3、100910-6D8呈现明显的阳性反应,由此可以判定单抗的抗原表位,分别将该区域逐一氨基酸截短表达后与对应单抗反应,结果表明⁵AIDITRK¹¹、⁷²RDELNVL⁷⁸、²²⁷ETHTLW²³²、²⁵¹KSKHNRREGY²⁶⁰、²⁶⁹DENGIVLD²⁷⁶、³⁴¹DETTLVRS³⁴⁸序列为该表位的核心序列。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-16
  1.1 乙型脑炎概述  10
  1.2 乙型脑炎流行病学  10-11
    1.2.1 流行现状  10-11
    1.2.2 流行病学  11
  1.3 乙型脑炎病原学及乙脑的危害  11-12
    1.3.1 病原学  11-12
    1.3.2 乙脑的危害  12
  1.4 乙型脑炎病毒的生物学功能与特性  12-14
    1.4.1 基因组结构  12
    1.4.2 蛋白的结构与功能  12-13
    1.4.3 非结构蛋白  13-14
  1.5 乙型脑炎的预防  14-15
  1.6 乙型脑炎的诊断  15
    1.6.1 病毒的分离鉴定  15
    1.6.2 血清学诊断方法  15
  1.7 本研究的目的意义  15-16
2 乙型脑炎病毒NS1 蛋白基因密码子优化  16-21
  2.1 材料  16-17
    2.1.1 菌种、质粒  16
    2.1.2 主要试剂  16
    2.1.3 Opti-NS1 基因的密码子改造  16-17
  2.2 方法  17-18
    2.2.1 opti-NS1 蛋白原核表达载体的构建  17-18
    2.2.2 Opti-NS1 与NS1 基因的诱导表达及表达产物的分析  18
    2.2.3 表达产物的Western-blot 检测  18
  2.3 结果  18-20
    2.3.1 重组质粒PET30a-opti-NS1 的酶切鉴定  18-19
    2.3.2 重组质粒PET30a-opti-NS1 的测序鉴定  19
    2.3.3 表达产物的SDS-PAGE 电泳分析  19
    2.3.4 表达产物的Western-blot 检测  19-20
  2.4 讨论  20-21
3 乙型脑炎病毒NS1 蛋白的可溶性表达与抗原性分析  21-26
  3.1 材料  21-22
    3.1.1 质粒、菌种与血清  21
    3.1.2 主要试剂  21
    3.1.3 NS1 融合蛋白重组表达质粒的构建  21
    3.1.4 重组融合蛋白的诱导表达与SDS- PAGE 分析  21
    3.1.5 MBP- NS1 的纯化重组菌进行大量诱导表达  21-22
    3.1.6 重组蛋白的Western blot 分析  22
    3.1.7 间接ELISA 方法的建立  22
  3.2 结果  22-25
    3.2.1 重组质粒pc5X- NS1 的构建  22-23
    3.2.2 表达产物的SDS- PAGE 电泳分析  23
    3.2.3 表达产物的纯化  23-24
    3.2.4 表达产物的western blot 检测  24
    3.2.5 表达产物的间接ELISA 建立  24-25
  3.3 讨论  25-26
4 乙型脑炎病毒 NS1 蛋白单克隆抗体的制备  26-36
  4.1 材料  26-27
    4.1.1 细胞与实验动物  26
    4.1.2 主要试剂  26
    4.1.3 试剂配制  26-27
  4.2 方法  27-30
    4.2.1 动物的免疫  27
    4.2.2 细胞融合  27-29
    4.2.3 阳性单克隆细胞株的筛选  29
    4.2.4 细胞的冻存  29
    4.2.5 杂交瘤细胞的复苏  29
    4.2.6 单抗腹水的制备  29-30
    4.2.7 单克隆抗体特性的鉴定  30
  4.3 结果  30-34
    4.3.1 免疫原的制备  30-31
    4.3.2 阳性杂交瘤细胞的筛选  31
    4.3.3 Western blot 结果  31-32
    4.3.4 间接免疫荧光试验结果  32-33
    4.3.5 单克隆抗体效价及亚型的测定  33-34
  4.4 讨论  34-36
5 乙型脑炎病毒 NS1 蛋白病毒特异性抗原表位的鉴定  36-50
  5.1 材料和方法  36-42
    5.1.1 实验材料  36
    5.1.2 NS1 蛋白的分段设计  36-39
    5.1.3 短肽融合蛋白的表达  39
    5.1.4 抗原表位的初步鉴定  39
    5.1.5 抗原表位的精确定位  39-42
  5.2 结果  42-46
    5.2.1 短肽融合蛋白的表达  42
    5.2.2 抗原表位定位  42-46
  5.3 表位截取后的结果  46-49
  5.4 讨论  49-50
6 结论  50-51
参考文献  51-55
作者简历  55-56
致谢  56-58
在读期间成发表的论文  58-59

乙型脑炎病毒NS1蛋白单克隆抗体制备及其表位的鉴定

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