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纳米羟基磷灰石/聚己内酯（nHA/PCL）复合材料对成骨细胞活性影响的实验研究

作　者: 刘介
导　师: 王朝元
学　校: 中南民族大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 纳米羟基磷灰石/聚已内酯(nHA/PCL) 成骨细胞骨相关基因表达碱性磷酸酶细胞增殖率细胞周期
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

在本研中我们研制了三种不同材料:nHA/PCL1,nHA/PCL2和PCL。本文通过研究nHA/PCL复合材料在体外培养条件下,对成骨细胞的细胞增殖、细胞周期变化、碱性磷酸酶活性、特别是对骨相关基因(ALP、BSP、Col I、OC、ON、OP等)的表达的影响,为该材料开发应用提供分子生物学基础。在本研究中,我们分离培养了新生小鼠颅盖骨成骨细胞,并进行了鉴定。结果显示:用改良组织块法分离的小鼠成骨细胞,在体外培养时细胞形态正常,并表现出较强的碱性磷酸酶活性。前六天碱性磷酸酶分泌水平持续增加。以小鼠成骨细胞系MC3T3-E1为模型,MTT实验结果表明,成骨细胞在不同nHA/PCL复合材料浸提液中的增殖速率不同。在nHA/PCL1和nHA/PCL2材料浸提液中生长的成骨细胞增殖速率高于PCL浸提液中,说明nHA相组分可以促进成骨细胞的增殖。同时,用流式细胞术研究nHA/PCL复合材料在体外对成骨细胞系MC3T3-E1细胞周期的影响。分别检测了在不同材料浸提液培养24小时、48小时和72小时后MC3T3-E1细胞的细胞周期时相。结果,成骨细胞在nHA/PCL复合材料浸提液中的增殖活性(PI)稍低于对照(细胞培养在DMEM培养基中),而在nHA/PCL1和nHA/PCL2复合材料浸提液中的成骨细胞的PI稍高于PCL浸提液中成骨细胞的PI,这一结果也说明nHA的加入可以提高成骨细胞在nHA/PCL复合材料上的增殖活性。用原代培养的小鼠颅盖骨成骨细胞为模型,研究了nHA/PCL相组分对原代成骨细胞的碱性磷酸酶活性的影响。在所有材料的浸提液中培养的前6天,成骨细胞的碱性磷酸酶活性持续增强。然后,随培养时间的增加,碱性磷酸酶活性逐渐降低,说明成骨细胞逐渐向成熟分化。在大部分时间点,生长在nHA/PCL2浸提液中的成骨细胞都表达出高于在其他材料浸提液中的碱性磷酸酶活性。说明,nHA组分的增加可以显著增强成骨细胞碱性磷酸酶的活性。本研究使用半定量反转录PCR分别检测2,6和12天生长在不同组分nHA/PCL复合材料片上成骨细胞骨相关基因的表达。结果显示,在所有材料上培养的成骨细胞中,骨桥蛋白和骨连蛋白mRNA随培养时间的增加,其表达量逐渐降低。相对于PCL,生长在nHA/PCL1和nHA/PCL2复合材料上的成骨细胞骨桥蛋白和骨连蛋白mRNA表达随培养时间的延长而迅速减弱。随培养时间延长,生长在所有材料上ME3T3-E1细胞的骨钙蛋白mRNA表达量都略有增加。但生长在nHA/PCL1和nHA/PCL2复合材料上的MC3T3-E1的骨钙蛋白mRNA的增加明显高于在PCL材料上。说明nHA/PCL复合材料中nHA组分可以调控成骨细胞骨相关基因的表达。本文通过研究不同相组分的nHA/PCL对成骨细胞增殖、细胞周期、碱性磷酸酶活性以及骨相关基因表达的影响,表明nHA/PCL2是一种有潜力的骨替换材料。通过进一步优化,有望开发一种新的nHA/PCL复合材料,用于临床骨修复。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
第1章前言  12-18
  1.1 NHA 的理化性质及其生物活性  15-16
    1.1.1 nHA 的理化性质  15
    1.1.2 nHA 的生物活性  15-16
  1.2 PCL 的理化性质及作为骨组织损伤修复生物材料研究进展  16
  1.3 NHA/PCL 复合材料的研究进展  16-17
  1.4 本论文研究工作的内容、方法和意义  17-18
第2章原代小鼠成骨细胞的分离、培养和鉴定  18-34
  2.1 引言  18-20
  2.2 材料和方法  20-27
    2.2.1 主要试剂、仪器和溶液配制  20-22
    2.2.2 实验方法  22-27
      2.2.2.1 小鼠颅盖骨原代细胞培养  22-25
      2.2.2.2 小鼠颅盖骨原代细胞特性研究  25-27
  2.3 实验结果  27-31
  2.4 讨论  31-34
第3章 NHA/PCL 复合材料浸提液对成骨细胞增殖的影响  34-39
  3.1 引言  34
  3.2 材料和方法  34-36
    3.2.1 实验材料  34-35
    3.2.2 实验方法  35
    3.2.3 统计学分析  35-36
  3.3 结果  36-37
  3.4 讨论  37-39
第4章 NHA/PCL 复合材料对成骨细胞细胞周期的影响  39-47
  4.1 前言  39-40
  4.2 材料和方法  40-41
    4.2.1 实验仪器、材料和试剂  40
    4.2.2 实验方法  40-41
    4.2.3 统计方法  41
  4.3 结果  41-46
  4.4 讨论  46-47
第5章 NHA/PCL 复合材料浸提液对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响研究  47-53
  5.1 前言  47
  5.2 材料和方法  47-48
    5.2.1 不同材料浸提液制备  47
    5.2.2 原代细胞在不同材料（浓度1596）浸提液中培养  47-48
    5.2.3 不同材料浸提液对碱性磷酸酶的活性测定  48
    5.2.4 成骨细胞总蛋白测定  48
    5.2.5 统计分析  48
  5.3 结果  48-51
  5.4 讨论  51-53
第6章 NHA/PCL 复合材料对骨相关基因表达的影响  53-66
  6.1 前言  53-54
  6.2 实验材料和方法  54-59
    6.2.1 实验材料，试剂和仪器  54-56
    6.2.2 实验方法  56-59
      6.2.2.1 材料处理和细胞培养  56
      6.2.2.2 RNA 提取  56-57
      6.2.2.3 cDNA 合成  57-58
      6.2.2.4 PCR 基因扩增  58-59
  6.3 结果与分析  59-63
    6.3.1 成骨细胞RNA 分析  59-60
    6.3.2 PCR 扩增体系优化  60
    6.3.3 骨相关基因表达的结果和分析  60-63
  6.4 讨论  63-66
参考文献  66-76
致谢  76-77
附录A（攻读硕士学位期间所发表的学术论文目录）  77

纳米羟基磷灰石/聚己内酯（nHA/PCL）复合材料对成骨细胞活性影响的实验研究

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