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子宫内膜边缘群干/祖细胞增殖与分化的研究

作　者: 徐静
导　师: 刘嘉茵
学　校: 南京医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: SP细胞 雌激素受体α(ERα) 雌二醇（E2） 增殖 分化
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究背景:干细胞是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞群体,根据其发育阶段又分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞是存在于发育成熟机体器官组织中的未分化细胞,是组织器官修复再生的基础。成体干细胞具有单向及多向发展潜能,长期以静止状态位于组织特定区域内,在组织损伤或发生疾病时可被激活开始分裂,参与组织增生修复,具有广阔的研究和应用前景。SP（side population）细胞,又称为边缘群细胞、侧群细胞,具有依赖膜蛋白ABCG2（ ATP-binding cassette superfamily G member 2 , ABCG2 ）将荧光染料Hoechst33342排出胞外的特性。研究发现SP细胞存在于小肠、结肠、肝、肺、肾等多种组织器官,是一类具有干细胞特性的细胞亚群。子宫内膜是一种具有高度增殖活性的组织,存在子宫内膜干细胞。前期工作中,我们在产后小鼠子宫内膜中发现了SP细胞群,鉴定后发现系一群不均一的干/祖细胞群,随产后时间点不同SP细胞含量呈现先升高后下降的单峰分布。研究目的:本文在成功分选与鉴定子宫内膜SP细胞的基础上,研究SP细胞体内、体外分化与增殖特性,研究分化与增殖的调控。通过分析小鼠产后不同时间点血清E2水平,子宫雌激素受体α（estrogen receptorα,ERα）表达水平的变化情况,结合SP细胞含量的变化趋势探讨三者内在联系;通过运用不同浓度E2作用于体外培养的SP细胞,研究E2对SP细胞体外增殖与分化的影响;同时将SP细胞接种裸鼠,予以外源性E2作用后观察SP细胞在体分化情况。这些研究为进一步探讨SP细胞在子宫内膜修复的作用和子宫内膜增殖异常相关疾病的病理机制奠定基础。材料与方法:（1）采用本实验室已建立的方法分选出SP细胞群。免疫荧光与RT-PCR方法检测SP细胞CK-18、Vimentin、αSMA与ABCG2的表达及定位,进行鉴定。（2）RT-PCR及免疫荧光检测SP细胞ERα表达。（3）测定产后不同时间点(d1、d3、d7、d14、d17.5、d21、d28)SP细胞含量变化,放射免疫法检测小鼠产后不同时间点(d1、d7、d14、d18、d21、d28)血清E2水平变化,RealtimePCR、Westernblot及免疫组化方法检测产后小鼠子宫ERα表达及定位。（4）运用不同浓度的E2(10-8M～10-6M)及E2+ICI182780（ERα抑制剂）作用于分选出的SP细胞24h后MTT实验检测SP细胞增殖变化;作用15天后计算SP细胞克隆形成率及大克隆形成率;作用3周后免疫荧光检测CK-18与Vimentin的表达。（5）将SP细胞注射于裸鼠肾包膜下,予以外源性E2,8周后,取双肾制蜡块切片行HE染色及免疫组化,检测CK-18、Vimentin、Desmin、αSMA的表达。结果: （1）RT-PCR及免疫荧光显示SP细胞表达ABCG2,非SP细胞不表达ABCG2;大部分SP细胞表达Vimentin,少量表达CK-18及αSMA。（2）RT-PCR与免疫荧光显示,SP细胞高表达ERα。（3）产后小鼠血清E2及子宫组织ERα表达均呈现先升高后逐步下降的趋势（P<0.05）。SP细胞含量随产后时间点变化呈现先升高后下降的单峰分布,产后17.5天左右达到峰值（13.95%）。产后d1 ERα少量表达于子宫内膜腔上皮细胞,d7间质及腺上皮细胞开始表达增加,d14～d18ERα在间质区及腺上皮表达显著增多,其中d14以间质细胞表达为主,d18以腺上皮细胞表达为主,d21ERα表达明显减少,d28仅间质极少量表达。SP细胞特异的ABCG2主要表达于产后子宫内膜间质区,少量位于血管内皮细胞及腺上皮,腔上皮没有表达。（4）与对照组相比,10-6M E2作用SP细胞24h后能明显促进SP细胞增殖（P<0.05）,这种作用能被ERα特异性的抑制剂ICI182780所阻断（P<0.05）。各E2浓度组之间SP细胞克隆形成率没有差异,10-7M、10-8M E2组SP细胞大克隆形成率明显下降（P<0.05）,且作用能被ICI182780阻断（P<0.05）。与对照组相比,各实验组之间CK-18的表达没有明显差异,10-8M E2组Vimentin的表达有增加的趋势。（5）8周后处死裸鼠取肾脏行HE染色于肾髓质区发现一团排列紧密的异常细胞团,已向周围肾小管间隙浸润,免疫组化显示该细胞群较明显的表达CK-18、Vimentin,少量表达Desmin,不表达αSMA。结论:（1）小鼠子宫内膜SP细胞系一群不均一干/祖细胞群,高表达ERα。（2）产后小鼠子宫内膜的SP细胞比率随产后时间点变化呈现先升高后下降的趋势。小鼠血清E2水平、子宫组织ERα的基因及蛋白表达水平也呈现与SP细胞率相似的变化曲线。与ABCG2主要表达部位相似,产后子宫组织ERα大部分也表达在间质及腺上皮。说明E2通过ERα介导作用于SP细胞参与了子宫内膜的修复。（3）E2经由ERα对SP细胞具有促增殖和促分化两方面的作用,在高浓度时促SP细胞增殖效应比较明显,而在接近生理浓度时则更突显促SP细胞分化的作用,尤其是向间质分化的趋势。（4）在E2作用下,小鼠产后子宫内膜SP细胞在体内可能具有分化出间质及上皮样组织结构的潜能,尤其是间质样结构。（5）这些研究为进一步探讨SP细胞在子宫内膜修复的作用和子宫内膜增殖异常相关疾病的病理机制奠定基础,也为子宫内膜SP细胞可能的实验和临床应用积累了研究资料。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-11
前言  11-13
第一部分 产后小鼠子宫内膜SP细胞的分离纯化及特性鉴定  13-18
  一、材料和方法  13-16
  二、结果  16-18
第二部分 SP细胞ERα表达  18-22
  一、材料和方法  18-20
  二、结果  20-22
第三部分 产后不同时间点SP细胞量、小鼠血清E_2 水平、子宫组织ERα表达及ABCG2 定位的相关性研究  22-33
  一、材料和方法  22-28
  二、结果  28-33
第四部分 雌二醇诱导SP细胞增殖及分化—in vitro和in vivo研究  33-43
  一、材料和方法  33-37
  二、结果  37-43
讨论  43-47
总结  47-48
参考文献  48-60
攻读学位期间发表文章情况  60-61
致谢  61

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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