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卡介苗疫苗株缺失区基因编码蛋白的研究

作　者: 秦丹丹
导　师: 蔡静平；张红梅
学　校: 河南工业大学
专　业: 微生物学
关键词: 结核分枝杆菌诊断抗原缺失区蛋白表达
分类号: R52
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所导致的慢性传染病,自上世纪80年代中期以来,结核杆菌感染趋势增高,迫切需要新的诊断抗原来准确地发现结核病人以便及时对其进行治疗。采用DNA芯片技术比较分析了结核分枝杆菌H37Rv和BCG的全基因组,发现两者间存在多个不同片段,这些片段被命名为RD(Regions of deletion,RD)区,依次编号为RD1-16,并证实其中有12个RD区片段在所有的卡介苗(M.bovis bacille Calmette-Guérin,BCG)中都缺失。研究这些缺失区基因所编码的蛋白,我们有可能发现新的、有价值的的特异性诊断抗原和作为新疫苗的抗原。本文对RD1区的Rv3874、Rv3875、RD4区的Rv0222、以及非RD区的Rv3615c进行研究。Rv3874和Rv3875能诱导机体产生细胞免疫反应和体液免疫反应,而且仅存在于致病性分枝杆菌中,BCG及其他非致病性分枝杆菌缺乏这二个基因,而且二者在结核诊断、预防中的应用已成为当前研究的热点。有国外研究报道表明,Rv0222比其他抗原具有较高水平的特异性和灵敏性,Rv3615c在细胞免疫水平上能够引起强烈的IFN-γ反应,但是还没有关于它的在体液免疫方面的报道。但由于菌种、地域差异等等原因,同样的抗原表现不尽相同,所以,从BCG缺失区基因编码的蛋白中筛选出有潜力作为我国结核病特异性诊断的抗原蛋白,以及验证RD区与非RD区抗原比较是否真的更具有免疫原性优势,将会使结核血清抗体检测技术真正成为临床重要的快速辅助检测手段。我们分别对结核分枝杆菌Rv0222、Rv3615c、Rv3874、Rv3875这四个基因进行了扩增并确定了最优的PCR反应条件,然后目的片段与载体pET32a(+)连接成重组质粒,鉴定正确后在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了相应的重组蛋白,通过亲和层析获得高纯度的重组蛋白,并获得了诱导以及纯化过程的最优参数,重组蛋白pET32a-0222、pET32a-3615c、pET32a-3874、pET32a-3875最适合的表达条件分别为:1.0mmol/L的IPTG,37℃,诱导5h;1.0mmol/L的IPTG,20℃,诱导6h;1.0mmol/L的IPTG,37℃,诱导3h;1.0mmol/L的IPTG,37℃,诱导4h。经Bradford检测,得到的重组pET32a-0222、pET32a-3615c,pET32a-3874蛋白终浓度分别为0.518 mg/mL、0.468mg/mL、1.697mg/mL。最终得到的蛋白为结核杆菌特异性诊断抗原的设计和筛选奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
第一章前言  10-25
  1.1 研究结核病诊断的意义  10-17
    1.1.1 结核病国内外现状  10-12
    1.1.2 结核病诊断策略  12-17
      1.1.2.1 细菌学检查  12
      1.1.2.2 分子生物学诊断  12-15
      1.1.2.3 免疫学检查  15-16
      1.1.2.4 结核病诊断新技术  16-17
  1.2 分子生物学与结核诊断抗原的研究  17-25
    1.2.1 反向遗传学技术与确定结核分枝杆菌抗原蛋白  17
    1.2.2 蛋白质组学技术与确定结核分枝杆菌抗原蛋白  17
    1.2.3 比较基因组学和生物信息学与确认卡介苗缺失区  17-19
    1.2.4 卡介苗缺失区蛋白作为诊断试剂的潜力  19-21
    1.2.5 其他抗原的诊断潜力  21-24
      1.2.5.1 单一抗原  21-23
      1.2.5.2 几种融合蛋白  23-24
    1.2.6 结核分枝杆菌检测展望  24-25
第二章实验材料与方法  25-38
  2.1 实验材料  25-29
    2.1.1 菌株与载体  25
    2.1.2 实验材料和试剂盒  25
    2.1.3 蛋白电泳试剂以及其他试剂  25-28
      2.1.3.1 蛋白电泳试剂  25-26
      2.1.3.2 蛋白电泳工作液  26-27
      2.1.3.3 考马斯亮蓝染液  27
      2.1.3.4 考马斯亮蓝脱色液  27
      2.1.3.5 Bradford 储存液及工作液  27
      2.1.3.6 其他试剂  27-28
    2.1.4 主要的仪器设备  28-29
  2.2 实验方法  29-38
    2.2.1 结核分枝杆菌的培养  29
    2.2.2 H37Rv 基因组DNA 抽提(小量细菌基因组DNA 抽提试剂盒)  29-30
    2.2.3 结核杆菌RD 区基因的克隆、表达及蛋白纯化  30-38
      2.2.3.1 结核分枝杆菌基因Rv0222、Rv3615c、Rv3874 和Rv3875 的引物设计  30
      2.2.3.2 PCR 扩增  30-31
      2.2.3.3 PCR 产物的纯化与回收  31-32
      2.2.3.4 pET32a(+)质粒的抽提  32-33
      2.2.3.5 PCR 产物与pET32a 载体的双酶切  33
      2.2.3.6 酶切胶回收后的目的基因与pET32a(+)载体的连接  33
      2.2.3.7 CaCl_2 法制备感受态细胞  33-34
      2.2.3.8 感受态细胞的转化  34
      2.2.3.9 快速鉴定重组质粒  34
      2.2.3.10 基因测序及结果分析  34
      2.2.3.11 Isopropyl-D-thiogalaetopyranoside(IPTG)诱导目标蛋白表达  34
      2.2.3.12 SDS-PAGE 电泳检测IPTG 诱导的蛋白表达  34-35
      2.2.3.13 重组蛋白表达条件的优化  35
      2.2.3.14 重组蛋白的亲和纯化  35-36
        2.2.3.14.1 表达上清液的制备  36
        2.2.3.14.2 亲和柱的预处理  36
        2.2.3.14.3 重组蛋白亲和层析纯化步骤  36
      2.2.3.15 重组蛋白的透析  36-38
第三章结果与讨论  38-55
  3.1 结核分枝杆菌H37RV 株基因组的抽提  38
  3.2 PET32a（+）质粒的抽提  38-40
  3.3 目的基因的克隆  40-42
  3.4 PCR 鉴定重组质粒  42-44
  3.5 目的基因插入PET32a（+）质粒后测序结果  44-46
  3.6 重组基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达  46-49
  3.7 重组蛋白的纯化  49-51
  3.8 Bradford 检测法测定纯化后蛋白浓度  51-55
第四章结论  55-56
参考文献  56-60
致谢  60-61
附录  61
附录1 重组质粒PET32a-0222 的测序报告  61-63
附录2 重组质粒PET32a-3615C的测序报告  63-65
附录3 重组质粒PET32a-3874 的测序报告  65-67
附录4 重组质粒PET32a-3875 的测序报告  67-69
附录5 PET32a(+)载体物理图谱  69-70
个人简历攻读硕士期间发表论文情况  70

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