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人源轮状病毒在胡萝卜中的表达

作　者: 刘满杏
导　师: 刘荣堂；李霞
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 野生动植物保护与利用
关键词: 轮状病毒转基因胡萝卜 VP6基因 VP7基因抗原抗体
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 13次
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内容摘要

本实验利用胡萝卜作为生物反应器受体生产轮状病毒外壳蛋白VP6,VP7。通过PCR,RT-PCR,Western Blot,ELISA检测整合有轮状病毒外源基因的胡萝卜植株,即从基因水平到蛋白水平逐步检测。并将蛋白水平上表达有轮状病毒外壳基因的胡萝卜植株免疫小鼠,免疫方法采用注射免疫和灌胃免疫。1提取胡萝卜DNA进行PCR分析,表明VP6,VP7,VP7-U基因都已整合到胡萝卜植株基因组中。2转基因植株的RT-PCR分析显示部分植株进行了反转录。3对转录水平上有表达的转基因植株进行Western Blot和ELISA分析,结果表明转基因胡萝卜植株可以有效地表达VP7蛋白,并具有一定的免疫原性。4利用转VP7基因胡萝卜根部蛋白注射免疫小鼠,抗原免疫量为1μg左右,免疫周期为两周,免疫三次后采血并提取小鼠血清进行ELISA分析,结果表明注射阳性胡萝卜植株蛋白的小鼠体内IgG含量要高于注射阴性胡萝卜植株蛋白的小鼠及未免疫的小鼠。利用转VP7-U基因胡萝卜根部蛋白灌胃免疫小鼠,抗原量为20-30μg,免疫周期为一周,免疫四次后采血提取血清并进行ELISA检测,结果表明灌服VP7-U基因的胡萝卜植株蛋白的小鼠IgG含量要高于灌服阴性植株的小鼠或未灌服小鼠的IgG的含量。5同时将转VP7-U基因的植株抗原量与VP7基因植株抗原量进行比较,ELISA分析表明,转VP7-U基因的植株抗原量要高于VP7基因植株抗原量。

全文目录

英文缩写一览表  4-8
中文摘要  8-9
ABSTRACT  9-10
第一章文献综述  10-17
  1.1 植物生物反应器的研究进展  10-12
    1.1.1 转基因植物疫苗的研究进展  10
    1.1.2 转基因植物疫苗的作用机理  10
    1.1.3 转基因植物疫苗的生产原理  10-11
    1.1.4 转基因植物生产疫苗的优势  11-12
  1.2 轮状病毒疫苗的研究进展  12-16
    1.2.1 轮状病毒的结构特征  12-13
    1.2.2 轮状病毒的致病机理  13
    1.2.3 轮状病毒疫苗的研究现状  13-16
  1.3 本论文研究的目的与意义  16-17
第二章材料与方法  17-25
  2.1 材料  17-18
    2.1.1 菌株  17
    2.1.2 动植物材料  17
    2.1.3 主要试剂  17
    2.1.4 引物合成及目的基因的测序  17
    2.1.5 主要仪器  17-18
  2.2 方法  18-25
    2.2.1 转基因植株基因组DNA 的提取  18-19
    2.2.2 转基因植物的PCR 扩增  19-20
    2.2.3 对各基因 PCR 产物进行基因测序,并利用 Dnaman 比对软件对测出的基因进行比对分析。  20
    2.2.4 转基因植物RNA 的提取  20
    2.2.5 转基因植株的RT-PCR  20
    2.2.6 转基因植株Western Blot 的检测  20-21
    2.2.7 轮状病毒VP6，VP7 蛋白在大肠杆菌中的提取及检测  21
    2.2.8 转基因胡萝卜蛋白免疫原性的检测  21-22
    2.2.9 胡萝卜总蛋白的测定  22
    2.2.10 转基因胡萝卜可溶性蛋白免疫小鼠  22-25
第三章结果与分析  25-40
  3.1 PCR 扩增反应  25-26
    3.1.1 DNA 检测结果  25
    3.1.2 PCR 结果  25-26
  3.2 RT-PCR 检测结果  26-29
    3.2.1 RNA 的提取结果  26-27
    3.2.2 RNA 中检测DNA 结果  27
    3.2.3 内参检测结果  27-28
    3.2.4 RT-PCR 结果  28-29
  3.3 Western Blot 分析结果  29-32
    3.3.1 转VP7 基因胡萝卜Western Blot 检测结果  29-30
    3.3.2 转VP7-U 基因胡萝卜Western Blot 结果  30-31
    3.3.3 VP6，VP7 阳性细菌蛋白Western Blot 检测结果  31-32
  3.4 转基因胡萝卜免疫原性的检测及抗原浓度的检测  32-35
    3.4.1 转基因胡萝卜中抗原活性的检测  32-33
    3.4.2 转VP7 基因和VP7-U 基因胡萝卜免疫原性的比较  33-34
    3.4.3 蛋白浓度的测定  34-35
  3.5 ELISA 方法检测免疫小鼠体内的IgG 变化  35-40
    3.5.1 注射不同蛋白的小鼠体内的IgG 比较  35-37
    3.5.2 灌服不同蛋白的小鼠体内的IgG 比较  37-40
第四章讨论  40-43
  4.1 植物生物反应器受体的选择  40
  4.2 外源基因在转基因植物中的表达  40-41
    4.2.1 造成外源基因表达量低的因素  40-41
    4.2.2 提高外源基因表达量的方法:  41
  4.3 实验过程讨论  41-43
参考文献  43-47
致谢  47-48
个人简介  48-49
导师简介  49

人源轮状病毒在胡萝卜中的表达

内容摘要

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