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不同铁负荷对仔猪Hepcidin mRNA表达量的影响

作　者: 党晓伟
导　师: 尹清强；李梦云
学　校: 河南农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: Hepcidin 猪缺铁铁超载 mRNA丰度
分类号: S828.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

Hepcidin是近年来新发现的一种调节小肠铁吸收的抗菌肽。本研究通过给3日龄仔猪注射不同剂量的右旋糖酐铁注射液构建仔猪缺铁和铁超载模型,利用实时荧光定量PCR技术研究不同铁负荷对仔猪Hepcidin基因表达量的影响,并克隆出猪Hepcidin的基因编码区,为治疗仔猪贫血和人类铁代谢疾病提供理论依据。通过给3日龄仔猪不注射或3倍量注射右旋糖酐铁构建仔猪缺铁和铁超载模型,用原子吸收法检测血清、肝脏和脾脏中铁的含量,同时对血清生化指标和氧化酶进行测定和分析。结果发现,铁超载组仔猪肝脏、脾脏和血清中铁的含量显著增加(P < 0.01),铁缺乏组中肝脏中铁的含量显著降低(P < 0.01),脾脏和血清中铁的含量分别减少了4.7倍和188倍(P > 0.05),模型构建成功;与对照组相比,铁超载组中碱性磷酸酶、白/球蛋白和甘油三酯含量显著降低(P < 0.05),总蛋白、球蛋白、总胆红素、直接胆红素、总胆固醇和高密度脂蛋白含量显著提高(P< 0.05);而铁缺乏组中碱性磷酸酶和总胆红素含量显著降低(P < 0.05),白/球蛋白和高密度脂蛋白含量显著提高(P < 0.05);铁超载组血清中丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶含量显著高于对照组(P < 0.05),超氧化物歧化酶含量增加了15.76%(P > 0.05);而铁缺乏组血清中谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、过氧化物酶含量显著降低(P < 0.05),丙二醛含量比对照组降低了3.49倍(P > 0.05),超氧化物岐化酶含量比对照组提高了61%(P > 0.05)。利用实时荧光定量PCR技术研究不同铁负荷对仔猪肝脏Hepcidin mRNA表达量的影响,结果表明,缺铁组Hepcidin mRNA表达量降低113倍,而铁超载组的表达量则升高了7倍,差异极显著(P < 0.01)。本试验成功提取了仔猪肝脏的mRNA,设计引物,利用RT-PCR扩增出Hepcidin基因的编码区,纯化回收目的基因,并连接到克隆载体PMD19-T中。经质粒PCR检测,XbaⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定及DNA测序,证实插入片段的DNA序列与Genebank中已经公布的猪Hepcidin基因序列的同源性达100%,编码82个氨基酸,预测的蛋白分子量和等电点分别为8.76 kDa和9.06,与已知牛的Hepcidin序列同源性达81.71%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律。

全文目录

致谢  4-9
内容摘要  9-10
Summary  10-11
引言  11-12
第一章文献综述  12-22
  1.1 铁  12-15
    1.1.1 铁在动物体内的总含量与分布  12
    1.1.2 铁的营养生理学功能  12-13
    1.1.3 铁的消化吸收和转运  13-14
    1.1.4 铁的代谢  14
    1.1.5 影响铁吸收的因素  14-15
      1.1.5.1 动物的年龄和种类  14
      1.1.5.2 饲料因素  14
      1.1.5.3 动物胃肠道的健康  14-15
      1.1.5.4 铁的含量、性质及机体内铁状态  15
  1.2 仔猪铁的营养  15-17
    1.2.1 仔猪缺铁的原因  15
    1.2.2 仔猪缺铁的表现  15-16
    1.2.3 仔猪补铁的方法  16
    1.2.4 仔猪补铁过量和铁中毒  16-17
  1.3 Hepcidin 与机体铁稳态  17-22
    1.3.1 Hepcidin 的分子结构特点  17-18
    1.3.2 Hepcidin 与机体铁稳态  18-19
    1.3.3 Hepcidin 与炎症和感染  19-20
    1.3.4 Hepcidin 与贫血和缺氧  20
    1.3.5 应用前景和展望  20-22
第二章缺铁和铁超载仔猪模型构建及生化指标检测  22-33
  2.1 材料和方法  22-24
    2.1.1 试验药品和试剂  22
    2.1.2 试验动物、地点和时间  22
    2.1.3 试验仪器  22
    2.1.4 试验设计  22
    2.1.5 样品的采集与处理  22
    2.1.6 测定指标  22-24
      2.1.6.1 内脏组织和血清中铁的含量  22-23
        2.1.6.1.1 样品的微波消解  22-23
        2.1.6.1.2 标准曲线溶液的配置  23
        2.1.6.1.3 上机检测  23
      2.1.6.2 抗氧化指标测定  23-24
      2.1.6.3 血清生化指标测定  24
      2.1.6.4 数据统计和分析  24
  2.2 结果与分析  24-27
    2.2.1 标准曲线  24-25
    2.2.2 血清和肝脾组织铁含量  25-26
    2.2.3 血清生化指标  26-27
    2.2.4 抗氧化能力  27
  2.3 讨论  27-33
    2.3.1 不同铁负荷对仔猪血清和内脏组织铁含量的影响  27-28
    2.3.2 不同铁负荷对仔猪血清生化指标的影响  28-31
      2.3.2.1 血清酶类  28
      2.3.2.2 血清蛋白和非蛋白氮  28-29
      2.3.2.3 血糖与胆红素  29-30
      2.3.2.4 血脂  30-31
    2.3.3 不同铁负荷对仔猪抗氧化能力的影响  31-33
第三章不同铁负荷对 Hepcidin mRNA 表达量的影响  33-41
  3.1 材料和方法  33-35
    3.1.1 试验动物和取材  33
    3.1.2 仪器设备  33
    3.1.3 酶与试剂  33
    3.1.4 引物设计和合成  33
    3.1.5 提取总RNA 前的准备工作  33-34
      3.1.5.1 试验器具的处理与准备  33-34
      3.1.5.2 提取时注意事项  34
    3.1.6 肝脏总 RNA 的提取和检测  34
    3.1.7 RT-PCR 扩增  34-35
    3.1.8 FQ-PCR 反应  35
    3.1.9 试验结果的处理  35
  3.2 结果与分析  35-39
    3.2.1 总RNA 质量检测  35-36
    3.2.2 引物质量评估  36
    3.2.3 熔解曲线  36-37
    3.2.4 扩增曲线  37-38
    3.2.5 不同铁负荷条件下肝脏内HepcidinmRNA的表达差异  38-39
  3.3 讨论  39-41
第四章 Hepcidin 基因编码区的克隆与序列分析  41-52
  4.1 材料与方法  41-46
    4.1.1 仪器设备  41
    4.1.2 试验动物  41
    4.1.3 质粒载体和感受态细胞  41
    4.1.4 主要试剂  41
    4.1.5 培养基  41
    4.1.6 溶液配制  41-42
    4.1.7 总RNA的提取  42
    4.1.8 Hepcidin基因的克隆  42-46
      4.1.8.1 RT-PCR 扩增  42
      4.1.8.2 PCR 引物设计  42
      4.1.8.3 PCR 扩增  42-43
      4.1.8.4 PCR 产物纯化回收  43-44
      4.1.8.5 Hepcidin基因与pMD19-T载体的连接  44
      4.1.8.6 连接产物的转化  44
      4.1.8.7 克隆Hepcidin DNA 片段的鉴定  44-46
  4.2 结果与分析  46-51
    4.2.1 RNA 的检测  46-47
    4.2.2 目的片段RT-PCR扩增  47
    4.2.3 Hepcidin 重组克隆的蓝白斑筛选  47-48
    4.2.4 Hepcidin 重组克隆的鉴定  48-49
    4.2.5 Hepcidin cDNA 测序与分析  49-51
  4.3 讨论  51-52
总结  52-53
参考文献  53-58

不同铁负荷对仔猪Hepcidin mRNA表达量的影响

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