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PUMA介导缺氧复氧大鼠心肌细胞凋亡的实验研究

作　者: 付晶晶
导　师: 万福生
学　校: 南昌大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: p53上调凋亡调制物(PUMA) 缺血再灌注损伤 缺氧复氧 心肌细胞 凋亡 RNA干扰
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


凋亡引起的心肌细胞损失是缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)的重要病理特征。阐明对心肌IRI中心肌细胞凋亡起关键性作用的蛋白质及其信号转导机制,对揭示心肌IRI的本质寻找并确立药物靶点,有效防治心肌IRI具有重要的现实意义。p53上调凋亡调制物(p53 upregulated modulator of apoptosis, PUMA)是近年发现促凋亡作用最强的BH3-only蛋白质家族成员之一,是Bax/Bak上游的主要促凋亡蛋白质,能隔离所有的Bcl-2抗凋亡蛋白质作用。PUMA在多种病理性因素的刺激下通过p53依赖和非依赖途径激活介导细胞凋亡,在凋亡通路上发挥着举足轻重的作用。本实验采用原代大鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型模拟在体心肌IRI,探讨促凋亡蛋白PUMA是否介导H/R诱导心肌细胞凋亡的发生?遏制PUMA表达是否可以下调心肌细胞凋亡而达到减轻H/R损伤的作用?第一部分:PUMA在大鼠心肌细胞H/R损伤中的作用及意义目的:应用乳鼠原代心肌细胞H/R损伤模型,探讨PUMA在大鼠心肌细胞H/R损伤中的作用及意义。方法:原代培养的心肌细胞被随机分为5组,实验重复3次。①正常对照(control)组;②H/R 2h组;③H/R 4h组;④H/R 6h组;⑤H/R 12h组。采用生化自动分析仪测定LDH活性、MTT法测定细胞存活率、Annexin V-FITC和PI联合染色的流式细胞术检测凋亡率、RT-PCR和Western blot方法检测PUMA及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的mRNA及蛋白的表达变化及分光光度法检测Caspase3活性变化。结果:1、H/R诱导心肌细胞凋亡H/R处理后心肌细胞凋亡率迅速上升,其中以H/R 6h最为明显,细胞凋亡率(23.44±4.16)%显著高于Control组(3.12±0.46)% (P<0.05);H/R 12h Caspase3活性达峰值为Control组的(4.57±0.48)倍(P<0.05)。2、H/R诱导PUMA及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达变化RT-PCR图像分析显示:PUMA mRNA H/R 2h开始升高(0.45±0.05),6h达峰值(0.76±0.06),持续到12h(0.71±0.07)仍高于Control组(0.29±0.02)(P<0.05);Bax mRNA在H/R 2h开始升高(0.63±0.07),6h达峰值(0.96±0.09),持续到12h(0.79±0.09)仍高于Control组(0.28±0.05)(P<0.05);与Control组(0.97±0.08)相比,Bcl-2 mRNA H/R 2h开始下降(0.82±0.07),12h降至最低(0.47±0.05)(P<0.05)。Western Blot图像分析显示:Control组中PUMA蛋白的表达量很低(0.08±0.01),H/R4h出现明显上调(0.33±0.04),6h显著升高(0.68±0.07),12h达峰值(0.72±0.07)(P<0.05);与Control组(0.28±0.04)相比,Bax蛋白H/R 2h开始升高(0.49±0.05),6h显著升高(0.92±0.08),12h达峰值(0.97±0.10)(P<0.05);与Control组(0.68±0.07)相比,Bcl-2蛋白H/R 2h开始降低(0.56±0.06),12h降至最低(0.26±0.02)(P<0.05)。结论:H/R诱导心肌细胞凋亡。PUMA在正常培养的心肌细胞中表达很低,心肌细胞H/R后迅速上调,其表达变化与心肌细胞凋亡率、Caspase3活性变化及凋亡相关蛋白Bax表达变化正相关,与Bcl-2表达变化负相关,提示促凋亡蛋白PUMA可能通过上调Bax表达及下调Bcl-2表达,导致Caspase3活性增加介导H/R诱导的心肌细胞凋亡。第二部分: PUMA特异性siRNA对大鼠心肌细胞H/R损伤的影响目的:应用脂质体转染的方法将PUMA特异性siRNA(si-PUMA)转染心肌细胞,探讨si-PUMA对心肌细胞H/R损伤的影响。方法:原代培养的心肌细胞被随机分为4组,实验重复3次。①正常对照(control)组;②H/R 6h组;③转染错义siRNA+ H/R 6h组(si-SCR);④转染si-PUMA +H/R 6h组(si-PUMA)。siRNA干扰心肌细胞PUMA表达36 h后,制备心肌细胞H/R损伤模型,在H/R 6h即PUMA表达最显著时间点,观察下调PUMA表达对心肌细胞H/R损伤的作用。观察指标和方法同前。结果:1、si-PUMA特异性下调心肌细胞PUMA表达。si-PUMA组PUMA mRNA(0.10±0.002)显著低于H/R 6h组(1.06±0.08)(P<0.05);si-PUMA组PUMA蛋白(0.33±0.04)显著低于H/R 6h组(0.84±0.09)(P<0.05)。2、与H/R 6h组(60.7±6.84)%相比,si-PUMA组细胞存活率(75.3±4.29)%明显上调(P<0.05);与H/R 6h组(1237±107 ) U/L相比,si-PUMA组LDH活性(802±55) U/L显著降低(P<0.05);与H/R 6h组(23.96±5.02)%相比,si-PUMA组细胞凋亡率(14.16±4.02)%明显下降(P<0.05)。3、与H/R 6h组(1.06±0.07)相比,si-PUMA组Bax蛋白(0.64±0.05)表达下调(P<0.05);与H/R 6h组(0.52±0.06)相比,si-PUMA组Bcl-2蛋白(0.68±0.08)表达上调(P<0.05);与H/R 6h组(4.62±0.34)相比,si-PUMA组Caspase3活性(2.97±0.25)活性下降(P<0.05)。结论:化学合成的si-PUMA可以通过脂质体方法高效转染心肌细胞。特异性干扰PUMA表达后,心肌细胞存活率升高、LDH溢出减少,凋亡率明显下调,其主要机制可能是si-PUMA干扰PUMA的促凋亡作用,导致Bax表达下调和Bcl-2表达上调而使Caspase-3的活化程度降低,造成心肌细胞凋亡率下降。提示si-PUMA对心肌细胞H/R损伤具有较好的保护作用。本文结论:1、促凋亡蛋白PUMA介导了H/R心肌细胞损伤,是H/R诱导心肌细胞凋亡的关键分子。2、提示PUMA可做为心肌IRI的治疗靶点,si-PUMA可用于心肌IRI分子治疗药物的筛选。可以通过基因治疗或是药物干预的方式,在适当程度上遏制PUMA的表达,减轻心肌IRI。

全文目录


摘要  5-9
ABSTRACT  9-15
引言  15-17
第一部分：PUMA 在大鼠心肌细胞H/R 损伤中的作用及意义  17-39
  1 材料与方法  17-29
    1.1 实验动物  17
    1.2 主要仪器与设备  17-18
    1.3 主要试剂  18-20
    1.4 实验方法  20-29
    1.5 统计处理  29
  2 结果  29-34
    2.1 原代大鼠心肌细胞培养生长状况  29-30
    2.2 心肌细胞H/R 后细胞损伤检测  30
    2.3 总RNA 提取样品的纯度与质量  30-31
    2.4 H/R 诱导PUMA 及凋亡相关基因表达变化  31-34
  3 讨论  34-39
    3.1 原代大鼠心肌细胞的分离与培养  34-35
    3.2 心肌细胞H/R 损伤模型的评价  35
    3.3 细胞凋亡与心肌IRI  35-36
    3.4 PUMA 的促凋亡作用  36-39
第二部分：PUMA 特异性 siRNA 对大鼠 心肌细胞 H/R 损伤的影响  39-51
  1 材料与方法  39-42
    1.1 实验动物  39
    1.2 主要仪器,设备  39
    1.3 主要试剂  39
    1.4 实验方法  39-42
    1.5 PUMA 表达下调对心肌细胞H/R 损伤的影响  42
    1.6 统计处理  42
  2 结果  42-48
    2.1 原代心肌细胞siRNA 最适转染浓度的筛选  42-44
    2.2 si-PUMA 对心肌细胞H/R 后PUMA mRNA 及蛋白的干扰效果  44-45
    2.3 PUMA 表达下调对心肌细胞H/R 损伤的影响  45-48
  3 讨论  48-51
    3.1 siRNA 转染原代心肌细胞的讨论  48-50
    3.2 PUMA 特异性siRNA 对心肌细胞H/R 损伤影响的讨论  50-51
全文总结  51
下一步工作计划及重点  51-52
致谢  52-53
附图  53-54
参考文献  54-58
攻读学位期间的研究成果  58-59
附带综述  59-67

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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