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抗传染性法氏囊病毒单抗的制备和VP2基因的序列分析

作　者: 黄成斌
导　师: 潘玲；余为一
学　校: 安徽农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus IBDV) VP2 单克隆抗体 高变区 序列分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


为了获得抗传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)的单克隆抗体,并对单抗进行分析鉴定,为传染性法氏囊病的诊断以及其抗原表位等研究提供依据。研究用传染性法氏囊病毒B87株和原核表达病毒VP2蛋白分别免疫小鼠制备单抗,然后对制备单抗进行鉴定与分析。具体如下:首先,通过IBDV B87株在鸡胚尿囊腔的增殖后采用超速离心法浓缩IBDV。将IBDV与弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/O用PEG进行细胞融合,以IBDV包被建立间接ELISA方法筛选出了四株抗IBDV的细胞株,命名为I8,I13,I25,I86。阳性细胞经过亚克隆纯化后扩大培养,体外制备单抗腹水,并对单抗腹水的ELISA效价,特异性,亚型,针对抗原表位等方面进行分析。间接ELISA结果表明,I8,I13,I25,I86分泌单抗效价分别为1:6×10~4,1:1×10~5,1:2×10~6,1:6×10~4,I25分泌单抗的ELISA效价相对较高。亚型分析表明,I8,I13,I25的亚型为IgG2b,I86亚型为IgG1。特异性试验结果证实,单抗腹水只与IBDV发生反应而不与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV),鸡胚尿囊液等发生反应,具有较好的特异性。相加ELSIA结果表明,I8与I13单抗针对的抗原表位相近,I8(I13)、I25、I86单抗间针对的抗原位点各不相同。用原核表达IBDV的VP2蛋白包被ELISA板,用I8,I13,I25,I86与其进行间接ELISA反应,单抗腹水经200倍稀释后均能与VP2蛋白反应,而阴性腹水不反应,表明IBDV免疫制备的单抗能特异性的识别IBDV的VP2蛋白。扩增IBDV B87株VP2基因的保守区域,将其克隆到原核表达载体PET-32a和PGEX4T-1上,对重组质粒进行PCR,双酶切,测序鉴定后,对其进行诱导表达,通过对诱导剂浓度,诱导时间,蛋白表达的可溶性分析等条件的优化摸索,大量表达了重组VP2蛋白。用NI纯化树脂对HIS-VP2蛋白进行纯化。并对重组蛋白的浓度,纯度以及免疫活性等进行检测。用HIS-VP2蛋白免疫小鼠,取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合,分别用HIS-VP2和GST-VP2蛋白包被建立间接ELISA筛选方法对融合细胞进行筛选,通过连续亚克隆最终获得了两株阳性细胞株,命名为V1,V38。通过体外方法制备单抗腹水,对单抗腹水的ELSIA效价,特异性,稳定性,抗原性等进行初步鉴定。SDS-PAGE结果显示,原核表达VP2蛋白具有很高的表达量,且以包涵体形式表达。纯化后HIS-VP2蛋白浓度达2.62mg/mL且纯度较高,能与IBDV免疫的多抗反应,具有抗原性。单抗鉴定结果表明,V1,V38单抗腹水的效价达到1:10~4以上,且V1,V38的单抗腹水针对的抗原表位不同,但均能与IBDV发生ELISA反应,具有较高的特异性和稳定性。为了探究安徽地区IBDV基因是否发生了变异及变异的程度,以便更好地为本地区IBD的防制工作提供依据。试验根据GenBank上已经发表的IBDV的核苷酸序列,设计并合成了一对特异性的扩增IBDV VP2高变区基因的引物,以临床上用IBDV金胶条快速诊断试纸确诊为IBDV的安徽株(分别命名为AH-1、AH-2、AH-7、AH-9)基因组为模版,利用RT-PCR技术扩增出长约567bp的VP2高变区基因片段,将其连接到PMD18-T载体上。经PCR鉴定及核苷酸序列测定证实,成功获得4个安徽分离株VP2高变区基因的重组质粒。将四株VP2高变区核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的11株IBDV相应序列应用生物学软件进行同源性比较,并构建系统进化树。同源性比较和进化树分析表明,IBDV安徽株分为两类,AH-2,AH-9与CU-1,B87,NB,D78,STC同属于一个分支,亲缘关系较近;而AH-1,AH-7与OKYM,HK46,G9201,UK661属于一个分支,亲缘关系较近。对IBDV安徽株VP2高变区氨基酸进行抗原性和毒力的分析表明目前安徽流行毒株在抗原上未发生质的反应,但在碱基和氨基酸上与经典毒株和疫苗株已经发生了一定的变异。AH-1,AH-7属于超强毒株,AH-2,AH-9为弱毒株,表明安徽既有弱毒株流行也存在着超强毒株,且超强毒株与欧美和日本流行的超强毒株在亲缘关系上较近,可能有着共同的来源。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-13
文献综述  13-21
引言  21-23
第一章IBDV 单克隆抗体的制备及其抗原表位初步分析  23-32
  1 材料与方法  23-28
    1.1 病毒、细胞株及试验动物  23
    1.2 主要试剂与器材  23
    1.3 主要试验试剂配制  23-24
    1.4 IBDV 病毒的增殖与纯化  24
    1.5 抗IBDV 单克隆抗体的制备  24-27
      1.5.1 IBDV 免疫Balb/c 小鼠  24
      1.5.2 骨髓瘤细胞和脾淋巴细胞准备  24-25
      1.5.4 间接ELISA 筛选方法的建立和阳性细胞株筛选  25-26
      1.5.5 阳性细胞株亚克隆和冻存与复苏  26
      1.5.6 单抗腹水的制备  26-27
    1.6 单抗的鉴定与分析  27-28
  2 结果与分析  28-31
    2.1 抗IBDV 单克隆抗体的制备  28
      2.1.1 间接ELISA 筛选方法的建立  28
      2.1.2 抗IBDV 单抗的筛选和亚克隆  28
    2.2 抗IBDV 单克隆抗体的鉴定  28-31
      2.2.1 ELISA 效价的测定  28-29
      2.2.2 单抗亚型的鉴定  29
      2.2.3 特异性分析  29
      2.2.4 细胞分泌抗体的稳定性试验  29
      2.2.5 单抗针对的抗原性分析  29-31
  3 讨论  31
  4 结论  31-32
第二章IBDV-VP2 基因的原核表达及其单克隆抗体的制备  32-54
  1 材料与方法  32-42
    1.1 载体、宿主菌与实验动物  32
    1.2 主要试剂和器材  32
    1.3 主要试剂配制  32-34
    1.4 IBDV-VP2 基因的克隆  34-37
      1.4.1 IBDV 总RNA 的提取与cDNA 的制备  34-35
      1.4.2 IBDV-VP2 基因的扩增  35
      1.4.3 重组质粒的构建  35-37
    1.5 pET32a-VP2，pGEX-4T-1-VP2 基因的诱导表达  37-40
      1.5.1 IPTG 诱导剂浓度的优化  37
      1.5.2 诱导时间的优化  37-38
      1.5.3 可溶性鉴定  38
      1.5.4 蛋白的大量制备  38
      1.5.5 HIS-VP2 蛋白的纯化  38-39
      1.5.6 HIS-VP2 蛋白的分析  39-40
    1.6 抗IBDV-VP2 蛋白单克隆抗体制备  40-41
      1.6.1 免疫  40
      1.6.2 细胞融合  40
      1.6.3 间接ELISA 筛选方法的建立和阳性株的筛选  40
      1.6.4 阳性细胞株亚克隆和细胞冻存与复苏  40
      1.6.5 单抗的大量制备  40-41
    1.7 单克隆抗体的鉴定与分析  41-42
      1.7.1 ELISA 效价的测定  41
      1.7.2 单抗亚类的鉴定  41
      1.7.3 特异性分析  41
      1.7.4 细胞分泌抗体的稳定性试验  41
      1.7.5 单抗针对的抗原性分析  41-42
  2 结果与分析  42-52
    2.1 IBDV-VP2 基因的克隆  42-43
      2.1.1 IBDV总RNA的提取  42
      2.1.2 IBDV-VP2 基因的扩增  42
      2.1.3 重组质粒的构建与鉴定  42-43
    2.2 目的基因的诱导表达  43-46
      2.2.1 IPTG 浓度优化结果  44-45
      2.2.2 诱导时间的优化  45
      2.2.3 表达蛋白的可溶性分析  45
      2.2.4 HIS-VP2 蛋白的纯化  45-46
    2.3 纯化蛋白的分析  46-47
      2.3.1 蛋白浓度的测定  46
      2.3.2 VP2 蛋白的抗原性分析  46-47
    2.4 抗IBDV-VP2 蛋白单克隆抗体制备  47-49
      2.4.1 间接ELISA 筛选方法的建立  47-49
      2.4.2 抗IBDV-VP2 单抗的筛选和亚克隆  49
    2.5 单克隆抗体的鉴定与分析  49-52
      2.5.1 ELISA 效价的测定  49
      2.5.2 单抗亚型的鉴定  49
      2.5.3 特异性分析  49-50
      2.5.4 细胞分泌抗体的稳定性试验  50
      2.5.5 单抗针对的抗原性分析  50-52
  3 讨论  52-54
第三章IBDV 安徽分离株VP2 基因的克隆及序列分析  54-63
  1 材料与方法  54-56
    1.1 载体、宿主菌及病料  54
    1.2 主要试剂和器材及主要试剂的配制  54
    1.3 病料采集和保存  54
    1.4 IBDV-VP2 高变区的克隆  54-55
      1.4.1 IBDV 总RNA 的提取与cDNA 的制备  54
      1.4.2 IBDV-VP2 高变区基因的扩增  54-55
      1.4.3 重组质粒的构建  55
    1.5 IBDV-VP2 高变区测序结果的序列分析  55-56
  2 结果  56-60
    2.1 IBDV 总RNA 提取和RT-PCR  56
    2.2 重组质粒的鉴定  56-57
    2.3 VP2 高变区测序结果分析  57-60
      2.3.1 VP2 高变区基因和推导氨基酸的序列分析  57-58
      2.3.2 VP2 高变区基因和推导氨基酸的同源性分析  58-59
      2.3.3 VP2 高变区基因和推导氨基酸的进化树分析  59-60
  3 讨论  60-62
  4 结论  62-63
参考文献  63-69
致谢  69-70
附录  70-71
作者简介  71

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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