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济宁青山羊皮肤毛囊的发育性变化与MTR-1A、IGF-1和TYR基因的差异表达研究

作　者: 董彬
导　师: 王慧
学　校: 山东农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 济宁青山羊皮肤毛囊褪黑素受体1A 类胰岛素生长因子1 酪氨酸酶组织切片荧光定量PCR
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

为揭示济宁青山羊皮肤毛囊的发育性变化规律及其候选基因的差异表达对皮肤毛囊生长和发育的影响,本研究采用组织学和实时荧光定量PCR等分子细胞生物学技术,对青山羊不同发育阶段皮肤毛囊的组织结构及其发育性变化规律和皮肤组织中褪黑素受体1A(MTR-1A)、类胰岛素生长因子1(IGF-1)和酪氨酸酶(TYR)基因的mRNA差异表达量进行了比较研究。主要研究结果如下:一、采用组织学与显微观测技术,比较研究了济宁青山羊胎儿羊(妊娠80-85d)、小猾皮(出生后3d)、大猾皮(出生后30d)和1龄成年羊皮肤毛囊的组织学结构,以及成年羊皮肤不同部位的组织学差异,结果表明:(1)胎儿羊(妊娠80-85d)胚胎性表皮分化为三层并增厚,真皮分化为两层,交织分布着成纤维细胞。在表皮区可以发现次级毛囊毛基的发生。(2)小猾皮毛囊层中的胶原纤维平行纵横交错,与网状层相比排列较为紧密;而网状层中的胶原纤维呈水平走向,为平行交织状排列。毛囊层内的弹性纤维细而弯曲,相互交织,纵横排列。网状层内无弹性纤维的分布。小猾皮的毛囊组织间隙较大,密度较稀,初级毛囊发达,次级毛囊较少。小猾皮每个毛囊群仅由2-3个初级毛囊和1-2个次级毛囊组成。(3)大猾皮毛囊层和网状层明显增厚,有粗大的胶原纤维束分布其中。大猾皮的毛囊密度和毛囊群直径极显著地大于小猾皮。次级毛囊密集排列在初级毛囊的周围。大猾皮毛囊群由1-5个初级毛囊和若干个次级毛囊组成,其中3毛囊群最多,发达的毛囊群使大猾皮表面粗糙。(4)成年羊皮肤毛囊层的厚度超过网状层,毛囊层内含有较多的结缔组织、胶原纤维和弹性纤维,形成致密的弹性纤维网。网状层中的胶原纤维粗大,胶原纤维呈平行疏松排列。成年羊皮肤初级毛囊较粗长,具有皮脂腺等附属结构,毛干有髓质;次级毛囊没有髓质且毛球较小,皮脂腺不发达或缺如。成年羊毛囊群和大猾皮相似,3毛囊群最多,占81.32%。(5)成年羊颈、背、腹和臀四个部位的皮肤厚度、表皮厚、真皮各层厚均以颈部最厚,背部次之,腹部最薄,颈部与背部、腹部差异极显著,背部与臀部差异不显著;四个部位的羊毛密度,以背部最密,腹部最稀(P>0.05)。羊毛细度在各个部位的差异不显著。毛囊群直径,以腹部最粗,背部次之,臀部最细(P<0.01)。初级毛囊和次级毛囊的深度,均以颈部最深,背部次之,臀部最浅(P<0.01)。二、采用实时荧光定量PCR技术,研究了MTR-1A、IGF-1和TYR基因在济宁青山羊胎儿羊、小猾皮、大猾皮和1龄成年羊背部皮肤组织中mRNA的差异表达量,结果表明:(1)MTR-1A在大猾皮的表达量极显著地高于其他三个时期(P<0.01),为胎儿期的19.5倍,为小猾皮的14.98倍,为1龄成年羊的8.87倍;IGF-1在大猾皮的表达量极显著地高于其他三个时期(P<0.01),为胎儿期的39.26倍,为小猾皮的24.61倍,为1龄成年羊的19.52倍;表明,MT和IGF-1参与调控次级毛囊的分化与发育。在大猾皮时期,MTR-1A和IGF-1的高表达说明,在此时期大量初级毛囊的毛纤维生长和次级毛囊毛基的发育启动了次级毛囊的毛纤维的发生和生长。(2)MTR-1A在1龄成年羊皮肤颈部和背部的表达量与臀部的表达量差异显著(P<0.05);IGF1在1龄成年羊皮肤颈部、背部和臀部的表达量与腹部的表达量差异显著(P<0.05)。成年羊皮肤组织中MTR-1A和IGF-1的差异表达以及毛囊群分布提示MT对初级毛囊的作用大于IGF-1。(3)MTR-1A和IGF-1的表达量与成年羊的羊毛细度存在一定的相关性(P>0.05),说明MT和IGF-1是影响羊毛细度的重要候选基因。(4)TYR在小猾皮和成年羊皮肤组织的表达量极显著地高于胎儿期和大猾皮阶段(P<0.01),其在小猾皮和成年羊背部皮肤中的表达量分别为胎儿期的14.4倍和10.89倍。TYR在小猾皮中的高表达说明,胎儿出生后,由于光照等环境因素的影响,位于毛囊乳头顶部的黑素细胞活化,皮肤组织中有大量黑素颗粒生成,在毛干堆积影响毛纤维的颜色。TYR在成年羊腹部皮肤的低表达与青山羊腹部羊毛多为白色有关。以上研究结果为揭示青山羊皮肤毛囊发育的分子遗传机理以及进一步揭示济宁青山羊毛色花纹品质形成的遗传机理奠定了基础。

全文目录

中文摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
1 文献综述  13-25
  1.1 济宁青山羊的种质特性  13
  1.2 哺乳动物皮肤和毛囊基本结构概述  13-17
    1.2.1 皮肤的基本结构  13
    1.2.2 毛囊的基本结构和细胞组成  13-14
    1.2.3 毛囊的发生  14
    1.2.4 毛囊的分化和发育  14-17
      1.2.4.1 初级毛囊的发育  14-15
      1.2.4.2 次级毛囊的发育  15-16
      1.2.4.3 毛囊干细胞  16-17
  1.3 动物毛囊生长发育的周期性调控  17-19
    1.3.1 动物毛囊生长发育的周期性变化  17
    1.3.2 动物毛囊周期性变化的形态特征  17
    1.3.3 初级毛囊与次级毛囊周期性形态特征  17-18
    1.3.4 动物毛囊生长发育与周期性变化的信号通路  18-19
  1.4 毛色形成机制  19-20
  1.5 影响济宁青山羊猾子皮品质的调控因子  20-24
    1.5.1 褪黑素受体IA对毛发生长的调节  21-22
    1.5.2 类胰岛素生长因子1对毛发生长的调节  22-23
    1.5.3 酪氨酸酶对毛色的调节机制  23-24
  1.6 本研究的目的和意义  24-25
2 材料与方法  25-33
  2.1 试验材料和样本采集  25
  2.2 主要仪器与试剂  25-28
    2.2.1 试验仪器  25
    2.2.2 组织切片试剂  25-26
    2.2.3 常规分子试剂  26
    2.2.4 细菌的转化和筛选阳性克隆所用试剂  26
    2.2.5 质粒提取用缓冲液和试剂  26-27
    2.2.6 RT-PCR 和qRT-PCR 相关试剂  27
    2.2.7 引物设计与合成  27-28
  2.3 试验方法  28-33
    2.3.1 皮肤组织的石蜡切片与显微观察  28
    2.3.2 青山羊皮肤组织总RNA 的提取、纯化与质量检测  28-29
    2.3.3 反转录合成cDNA  29-30
    2.3.4 PCR 扩增及其检测  30
    2.3.5 目的cDNA 片段的回收与纯化  30-31
    2.3.6 目的PCR 产物与载体的连接  31
    2.3.7 目的片段转化大肠杆菌  31
    2.3.8 荧光定量PCR  31-32
      2.3.8.1 标准曲线和熔解曲线的建立  31-32
      2.3.8.2 荧光定量PCR 反应条件的优化  32
    2.3.9 实验数据的统计分析方法  32-33
3 结果与分析  33-44
  3.1 济宁青山羊皮肤毛囊形态结构的发育性变化规律  33-37
    3.1.1 青山羊皮肤组织的发育性变化规律  34
    3.1.2 成年羊皮肤不同部位的组织学变化  34-35
    3.1.3 青山羊毛囊的发育性变化规律  35-36
    3.1.4 成年羊皮肤不同部位毛囊的组织学形态  36-37
  3.2 青山羊皮肤MTR-1A 基因的差异表达与发育性变化  37-40
    3.2.1 MTR-1A 基因的测序结果  37-38
    3.2.2 MTR-1A 和GAPDH 基因的荧光定量标准曲线与熔解曲线  38
    3.2.3 青山羊皮肤组织中MTR-1A 基因的差异表达与发育性变化  38-39
    3.2.4 成年青山羊皮肤不同部位MTR-1A 基因的差异表达  39-40
  3.3 青山羊皮肤IGF-1 基因的差异表达与发育性变化规律  40-41
    3.3.1 IGF-1 的荧光定量标准曲线与熔解曲线  40
    3.3.2 青山羊皮肤组织中IGF-1 基因的差异表达与发育性变化  40-41
    3.3.3 成年青山羊皮肤不同部位IGF-1 基因的差异表达  41
  3.4 青山羊皮肤TYR 基因的差异表达与发育性变化规律  41-43
    3.4.1 TYR 基因的荧光定量标准曲线与熔解曲线  42
    3.4.2 青山羊皮肤组织中TYR 基因的差异表达与发育性变化  42-43
    3.4.3 成年青山羊皮肤不同部位TYR 基因的差异表达  43
  3.5 成年羊皮肤IGF-1 和MTR-1A 的差异表达与羊毛细度  43-44
4 讨论  44-47
  4.1 济宁青山羊成年羊皮肤的组织学结构  44
  4.2 济宁青山羊毛囊的组织学结构和发育性变化规律  44-45
  4.3 关于不同发育阶段MTR-1A 基因的差异表达  45
  4.4 关于不同发育阶段IGF-1 基因的差异表达  45-46
  4.5 关于不同发育阶段TYR 基因的差异表达  46
  4.6 关于成年羊皮肤不同部位毛囊组织学与基因差异表达  46-47
5 结论  47-50
  5.1 济宁青山羊皮肤毛囊组织学特性与发育性变化  47-48
  5.2 MTR-1A 在青山羊不同发育阶段皮肤组织中差异表达  48
  5.3 IGF-1 在青山羊不同发育阶段皮肤组织中差异表达  48-49
  5.4 TYR 在青山羊不同发育阶段皮肤组织中差异表达  49
  5.5 成年羊皮肤IGF-1 和MTR-1A 的差异表达与羊毛细度  49
  5.6 济宁青山羊猾子皮的毛色和花纹  49-50
参考文献  50-59
致谢  59-60
攻读学位期间发表论文情况  60

济宁青山羊皮肤毛囊的发育性变化与MTR-1A、IGF-1和TYR基因的差异表达研究

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