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酸性蛋白酶基因在毕赤酵母及黑曲霉中的表达

作　者: 路博
导　师: 李杰
学　校: 东北农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 酸性蛋白酶毕赤酵母丝状真菌基因置换同源重组
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类,其最适作用pH值为2.5~5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性,因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。宇佐美曲霉是工业化生产酸性蛋白酶的主要菌种,但是酸性蛋白酶的表达受碳源和氮源阻遏的调控和蛋白质的诱导,并受严格的pH控制,导致其发酵条件不易控制,发酵酶活不稳定。利用宇佐美曲霉工业化生产酸性蛋白酶的酶活还有待进一步提高。真核生物表达系统是高效表达蛋白的有效手段。酵母作为表达外源蛋白的工程菌日益受到重视。它具有基因表达调控和蛋白修饰功能,克服了原核表达系统中产物活性低以及包涵体的变性、复性等的问题。而且,酵母可以通过高密度发酵,且分泌产物与天然蛋白相似,临床应用较安全。同样黑曲霉卓越的表达和分泌能力也一直是吸引人们的最大特点。并具有真核分泌机制,很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能,如高甘露糖型和N-糖基化等,也是表达真核基因的理想系统。通过基因工程手段在酵母和黑曲霉中高效表达酸性蛋白酶,对于简化发酵条件、提高酶制剂产量都具有重要意义。本研究以酸性蛋白酶基因生产菌种宇佐美曲霉为基因供体,克隆酸性蛋白酶基因(pepA),构建其毕赤酵母表达载体,并通过电击法转化毕赤酵母,以获得高效表达酸性蛋白酶的工程菌。同时,试图通过农杆菌介导法敲除糖化酶生产菌黑曲霉的pyrA基因和ku70基因,获得黑曲霉受体菌,并构建农杆菌介导的pepA基因同源重组载体,为黑曲霉表达系统的建立和实现pepA基因在黑曲霉中的高效表达奠定基础。主要研究成果如下:1.基因的克隆采用RT-PCR方法克隆得到了宇佐美曲霉pepA基因的cDNA序列,采用PCR方法克隆得到了黑曲霉pyrA基因,黑曲霉ku70基因5′和3′同源臂基因,黑曲霉glaA基因启动子和终止子,瑞氏木霉pyrG基因,以及宇佐美曲霉pepA基因。测序结果正确。2.酸性蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达构建了pepA基因的毕赤酵母表达载体pGAPHαm-pepAc。将载体线性化并通过电击转化毕赤酵母。经转化子PCR鉴定得到重组子GS115-pGAPHαm-pepAc。在最适发酵条件下,GS115-pGAPHαm-pepAc分泌表达的酸性蛋白酶最高酶活为1289.68u/mL。3.黑曲霉表达载体构建构建了pyrA、ku70、glaA、pepA基因的相关载体pEMT-pyrA,pEMT-△pyrA,pEMT-△kusA,pEMT-△kusA-pyrG,pEMT-△glaA-pepA,并将这些载体通过冻融法转入到根癌农杆菌GV3101中,以用于下一步转化黑曲霉。4.黑曲霉pyrA基因缺失突变菌株的构建以黑曲霉UV48为受体材料,利用农杆菌介导法将表达载体pEMT-△pyrA对黑曲霉进行遗传转化。筛选培养基中加入5-氟乳清酸,获得了一些抗性菌株,但经过PCR鉴定后,发现这些抗性菌株并非pyrA基因缺失突变菌株。此实验在进一步进行中。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
1 引言  12-25
  1.1 研究的目的与意义  12-13
  1.2 文献综述  13-24
    1.2.1 酸性蛋白酶研究进展  13-15
    1.2.2 毕赤酵母表达系统研究进展  15-18
    1.2.3 丝状真菌表达系统研究进展  18-24
  1.3 本论文的主要研究内容  24-25
2 材料与方法  25-33
  2.1 实验材料  25-27
    2.1.1 菌种与载体  25
    2.1.2 试剂及酶类  25
    2.1.3 酶活测定所需试剂的配制  25-26
    2.1.4 培养基  26
    2.1.5 基因扩增引物  26-27
  2.2 实验方法  27-33
    2.2.1 宇佐美曲霉RNA 的提取  27-28
    2.2.2 RNA 的反转录  28
    2.2.3 黑曲霉/瑞氏木霉DNA 的提取  28-29
    2.2.4 基因的扩增  29-30
    2.2.5 表达载体的构建  30
    2.2.6 毕赤酵母的转化  30-31
    2.2.7 根瘤农杆菌介导的遗传转化  31
    2.2.8 重组子的鉴定  31-32
    2.2.9 重组子的表达  32-33
3 结果与分析  33-58
  3.1 宇佐美曲霉pepA 基因在毕赤酵母中的表达  33-38
    3.1.1 宇佐美曲霉RNA 的提取  33
    3.1.2 毕赤酵母表达用pepA 基因的克隆  33-34
    3.1.3 pepA 基因酵母表达载体构建  34-35
    3.1.4 毕赤酵母的转化  35-37
    3.1.5 重组菌株的表达  37-38
  3.2 宇佐美曲霉pepA 基因在黑曲霉中的表达  38-58
    3.2.1 黑曲霉pyrA 基因缺失突变体的构建  38-44
      3.2.1.1 pyrA 基因的克隆  38-39
      3.2.1.2 pyrA-基因的获得  39-40
      3.2.1.3 pyrA 基因和pyrA-基因表达载体的构建  40-42
      3.2.1.4 重组质粒冻融法转化农杆菌  42-43
      3.2.1.5 根瘤农杆菌介导pyrA-基因转化黑曲霉UV48  43-44
    3.2.2 黑曲霉kusA（ku70）基因缺失突变体的构建  44-51
      3.2.2.1 kusA 5'同源臂和3'同源臂基因、瑞氏木霉pyrG 基因表达框的克隆  44-47
      3.2.2.2 黑曲霉 kusA-（ku70-）基因表达载体的构建  47-50
      3.2.2.3 kusA-基因表达载体冻融法转化农杆菌  50-51
    3.2.3 宇佐美曲霉pepA 基因替换glaA 基因的研究  51-58
      3.2.3.1 glaA 基因启动子和终止子、宇佐美曲霉酸性蛋白酶 pepA 基因的克隆  51-54
      3.2.3.2 宇佐美曲霉 pepA 基因表达载体的构建  54-58
4 讨论  58-60
  4.1 重叠延伸PCR 的应用  58
  4.2 转化子的筛选  58
  4.3 丝状真菌同源重组效率低的问题  58-59
  4.4 毕赤酵母的转化  59-60
5 结论  60-61
  5.1 基因的扩增  60
  5.2 表达载体的构建  60
  5.3 毕赤酵母的转化  60
  5.4 pepA 基因在毕赤酵母中的表达  60
  5.5 农杆菌介导的遗传转化  60-61
致谢  61-62
参考文献  62-67
攻读硕士学位期间发表的学术论文  67

酸性蛋白酶基因在毕赤酵母及黑曲霉中的表达

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