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高产γ-癸内酯酵母基因工程菌的构建

作　者: 冯春利
导　师: 宋焕禄
学　校: 北京工商大学
专　业: 食品科学
关键词: γ-癸内酯 基因敲除 同源重组 自克隆 Yarrowia lipolytica 酰基-CoA氧化酶
分类号: TS202.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


γ-癸内酯是一种食品添加剂,其主要用于配制奶油、草莓、桃子、柑橘和椰子等香料的内酯类香味化合物,具有很浓郁的香气,是国际公认安全的食品添加剂和药品添加剂。由微生物发酵生产得到的γ-癸内酯在香料工业中被誉为“天然”的香料。许多微生物都能利用底物蓖麻油酸发酵生产γ-癸内酯,然而在众多能产γ-癸内酯的菌株中,解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica发酵生产γ-癸内酯的量比较高。本文以解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica AS2.1045为出发菌株,对其进行分子生物学改造,使其高产γ-癸内酯。主要实验内容及结论如下:为了构建高产γ-癸内酯的营养缺陷型Yarrowia lipolytica酵母菌,首先利用基因同源重组的方法敲除掉尿嘧啶合成酶关键基因URA3基因,用尿嘧啶营养缺陷型培养基(SD-URA)添加一定浓度的5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶筛选获得转化子。得到的尿嘧啶营养缺陷型菌株,当菌株生长达到一定浓度后,可以在不含有尿嘧啶的发酵培养基中,抑制蓖麻油酸的一个旁路代谢途径和细胞生长,使其转回内酯的合成途径,从而提高香味物质γ-癸内酯产量。因此尿嘧啶含量则成为影响营养缺陷型菌株发酵生产γ-癸内酯的最关键因素。在获得了营养缺陷型菌株后,对营养缺陷型菌株和野生型菌株进行了含尿嘧啶培养基发酵条件的优化,最终得到了营养缺陷型菌株发酵γ-癸内酯产量的最佳条件:蓖麻油5%,蛋白胨0.5%,吐温-80 0.4%,酵母浸膏0.25%,MgSO4?7H2O 0.3%,NaCl 0.5%,尿嘧啶添加量为5ng/μl.然后在最佳条件下对比野生型菌株和营养缺陷型菌株的发酵产量。在58h左右,原始菌株产γ-癸内酯的量达到最大值199.3 mg/L,而缺陷型菌株在63h时达到最大量为1032.9mg/L。其次利用酵母本身的铜抗性基因CRF1的自克隆作为筛选标记,将CRF1基因插入POX3基因内部,替换掉POX3基因内部一部分序列,然后将构建的POX3基因敲除组件pMPC1转化酵母Yarrowia lipolytica AS2.1045,敲除掉影响γ-癸内酯产量的关键基因POX3基因。由于铜抗性基因CRF1的自克隆表达,使转化子菌株获得铜抗性,达到了11mM硫酸铜浓度,然而野生型不能在含此硫酸铜浓度的培养基上生长。通过对转化子和野生型酵母菌目的基因进行PCR扩增测序,从而验证得到了敲除POX3基因的工业生产菌株TA1。对获得的敲除掉POX3基因的菌株TA1进行发酵培养基优化条件,首先对碳源、氮源、发酵温度、pH值、接种量、装液量进行了单因素条件优化,然后又对碳源、发酵温度、pH值、接种量进行了四因素三水平的正交实验分析。从而得到了最佳发酵培养条件:蓖麻油5%、酵母浸膏0.25%、蛋白胨0.5%、吐温-80 0.4%、MgSO4?7H2O 0.3%、NaCl 0.5%、pH值7.0、接种量8%(菌液浓度为1.6×107个/mL),250 mL三角瓶中装液量115mL,温度28℃,转速150r/min。在最佳发酵培养条件下,进行转化子TA1和野生型菌株的发酵培养,在60h左右,POX3基因敲除菌株TA1最大产量为630.9mg/l,而野生型菌株仅为199.7mg/l,在POX3基因敲出后,产量提高了2.13倍。由此得到更高产量的高产菌株TA1。该菌株传代50次后产量很稳定。以此确定得到了高产γ-癸内酯的工业菌株。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第一章 前言  11-20
  1.1 微生物发酵生产天然γ-癸内酯的机理  11-12
  1.2 对发酵生产γ-癸内酯的Yarrowia lipolytica 进行的基础性研究  12-13
  1.3 Yarrowia lipolytica 产γ-癸内酯的相关基因的功能研究  13-15
  1.4 国外进行相关基因研究所采用的技术与方法  15-17
  1.5 本实验所采取的基因敲除和自克隆技术  17-18
  1.6 本论文的工作意义及主要内容  18-20
第二章 Yarrowia lipolytica 酵母AS 2.1405 URA3 基因的敲除及产γ-癸内酯培养条件的优化  20-56
  2.1 材料  20-27
    2.1.1 菌株和质粒  20
    2.1.2 工具酶  20-21
    2.1.3 引物设计  21
    2.1.4 主要试剂  21-24
    2.1.5 培养基  24-25
    2.1.6 主要实验仪器  25-27
  2.2 实验方法流程  27-40
    2.2.1 菌种活化  28
    2.2.2 液体种子培养  28-29
    2.2.3 酵母基因组DNA 提取  29
    2.2.4 目的基因的PCR 扩增  29-30
    2.2.5 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测  30-31
    2.2.6 目的片段DNA 的回收  31-32
    2.2.7 回收片段的检测  32
    2.2.8 感受态大肠杆菌制备和转化  32-33
    2.2.9 质粒M13 的大量提取  33
    2.2.10 M13 质粒和URA3 基因的酶切  33-34
    2.2.11 酶连及重组质粒M13-URA3 的构建  34-35
    2.2.12 重组质粒M13-URA3 的转化和筛选  35
    2.2.13 重组质粒M13-URA3 快速抽提  35
    2.2.14 重组质粒的提取  35
    2.2.15 重组质粒M13-URA3 的鉴定  35-36
    2.2.16 URA3 基因敲除质粒的构建  36-37
    2.2.17 URA3 基因敲除质粒的酶切和PCR 扩增鉴定  37
    2.2.18 将URA3 基因敲除组件转化酵母  37-38
    2.2.19 尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建及筛选  38
    2.2.20 尿嘧啶营养缺陷型菌株的分子生物学验证  38
    2.2.21 尿嘧啶营养缺陷型菌株初步摇瓶发酵  38-39
    2.2.22 γ-癸内酯粗样的制备  39
    2.2.23 γ-癸内酯的气相色谱检测  39
    2.2.24 γ-癸内酯标准曲线的绘制以及含量测定  39
    2.2.25 确定最佳的尿嘧啶添加浓度  39-40
  2.3 实验结果与分析  40-54
    2.3.1 酵母基因组DNA 提取  40
    2.3.2 目的基因URA3 基因的PCR 扩增  40-41
    2.3.3 PCR 产物切胶回收  41-42
    2.3.4 原始质粒M13 提取  42
    2.3.5 酶连及重组质粒构建  42-45
    2.3.6 构建URA3 基因敲除组件  45-46
    2.3.7 利用基因敲除组件转化酵母  46-47
    2.3.8 URA3 基因敲除和营养缺陷型菌株的初步筛选  47-49
    2.3.9 营养缺陷型菌株的进一步筛选鉴定  49-50
    2.3.10 尿嘧啶营养缺陷型菌株的培养基验证和分子生物学鉴定  50-51
    2.3.11 γ-癸内酯检测方法的确定及标准曲线的绘制  51-52
    2.3.12 原始菌株和缺陷型菌株γ-癸内酯生产曲线的绘制  52
    2.3.13 不同浓度梯度尿嘧啶发酵培养基产γ-癸内酯的量  52-53
    2.3.14 营养缺陷型菌株和野生型菌株产γ-癸内酯量的分析  53-54
  2.4 本章小结  54-56
第三章 敲除解脂耶氏酵母POX3 基因提高γ-癸内酯产量  56-74
  3.1 材料与方法  56-58
    3.1.1 菌株与质粒  56
    3.1.2 酶与主要试剂溶液  56-57
    3.1.3 引物设计  57
    3.1.4 培养基  57
    3.1.5 主要实验仪器  57-58
  3.2 实验方法  58-65
    3.2.1 铜离子对该酵母最低杀伤浓度的确定  58
    3.2.2 POX3 基因和铜抗性CRF1 基因的PCR 扩增  58-59
    3.2.3 pMX3 质粒载体的构建  59-61
    3.2.4 POX3 基因敲除组件pMPC1 的构建  61-63
    3.2.5 POX3 基因的敲除和筛选  63-64
    3.2.6 POX3 基因敲除后转化子的摇瓶发酵和γ-癸内酯粗提取  64
    3.2.7 γ-癸内酯的气相色谱检测  64
    3.2.8 γ-癸内酯的标准曲线  64-65
  3.3 结果与讨论  65-70
    3.3.1 POX3 基因和CRF1 基因的PCR 扩增  65
    3.3.2 基因敲除组件的构建过程  65-66
    3.3.3 pMX3 质粒的快抽质粒的酶切鉴定  66
    3.3.4 POX3 基因敲除组件pMPC1 的酶切和PCR 鉴定  66-68
    3.3.5 转化子和野生型的铜抗性比较  68-69
    3.3.6 转化子TA1 的分子生物学鉴定  69
    3.3.7 POX3 基因敲除后转化子的摇瓶发酵和γ-癸内酯粗含量检测  69-70
  3.4 讨论  70-72
    3.4.1 目的片段DNA 回收率的影响  70-71
    3.4.2 酶切实验中的影响因素  71
    3.4.3 关于转化率的个人经验总结  71-72
  3.5 本章小结  72-74
第四章 POX3 基因敲除菌株TA1 发酵条件的优化  74-88
  4.1 材料与方法  74-78
    4.1.1 实验菌株  74
    4.1.2 主要实验仪器  74-75
    4.1.3 主要实验试剂  75
    4.1.4 培养基  75-76
    4.1.5 γ-癸内酯分析方法  76
    4.1.6 最适碳源的确定  76
    4.1.7 最佳氮源的确定  76
    4.1.8 最佳发酵温度的确定  76
    4.1.9 最佳pH 值的确定  76-77
    4.1.10 最适接种量的确定  77
    4.1.11 最佳装液量的确定  77
    4.1.12 进一步正交优化发酵培养基  77
    4.1.13 对发酵最佳条件进行验证  77
    4.1.14 转化子TA1 菌株在最有条件下发酵产γ-癸内酯量的过程  77-78
  4.2 结果与分析讨论  78-86
    4.2.1 最佳碳源的确定  78-79
    4.2.2 最佳氮源的确定  79
    4.2.3 最佳温度的确定  79-80
    4.2.4 最佳pH 值的确定  80-81
    4.2.5 接种量对发酵的影响  81-82
    4.2.6 装液量对发酵的影响  82-83
    4.2.7 正交实验确定最佳发酵条件  83-85
    4.2.8 最佳发酵条件的验证  85
    4.2.9 转化子TA1 和营养缺陷型发酵γ-癸内酯的过程比对  85-86
    4.2.10 转化子TA1 遗传稳定性的考察  86
  4.3 本章小结  86-88
第五章 结论与展望  88-90
  5.1 结论  88-89
  5.2 展望  89-90
参考文献  90-94
附录A  94-95
附录B  95-96
附录C  96-97
附录D  97-99
附录E  99
附录F  99-100
在学期间发表的论文及科研成果清单  100-101
致谢  101

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 食品原料及添加剂 > 食品添加剂
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