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猪瘟病毒E~(rns)蛋白在毕赤酵母中的表达及其单克隆抗体制备
作 者: 李艳蕊
导 师: 刘磊;李学伍
学 校: 甘肃农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒 Erns蛋白 巴斯德毕赤酵母 单克隆抗体
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的以高热、出血、死亡率高为特征的一种高度接触性传染病,严重影响养猪业的健康发展。该病毒的结构蛋白Erns是病毒吸附进入敏感细胞的必须蛋白,同时也是病毒诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原之一,可诱导免疫猪产生对致死量CSFV的保护性免疫。根据国内CSFV流行毒株的序列,设计合成了一对引物,利用PCR扩增了主要的保护性抗原Erns蛋白的编码基因序列,将PCR扩增产物按设计的酶切位点与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了重组表达质粒pPIC9K-Erns。用SalⅠ将重组表达质粒线性化后,电转化入GS115酵母菌。经筛选、鉴定,继而甲醇诱导,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,并将表达蛋白纯化,并对纯化Erns蛋白进行了Western-blot分析。实验结果表明重组的GS115酵母菌株可表达分泌Erns蛋白,其表达在72h时达高峰,分泌量可达240mg/L;对纯化Erns蛋白的Western-blot结果显示,该蛋白能被CSFV抗体特异性识别,且具有很好的反应原性。以Erns蛋白为诊断抗原,初步建立了间接ELISA诊断方法,确定最佳抗原包被浓度和血清稀释倍数分别为4μg/ml和1︰400。用纯化的Erns蛋白来免疫8周龄BALB/c雌性小鼠,利用细胞融合技术,经间接ELISA检测方法筛选和有限稀释法亚克隆,获得了3株分泌抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A6H,A3E,C3G,并对其生物学特性进行了鉴定。间接ELISA测得杂交瘤细胞株A6H,A3E,C3G培养上清效价分别为1︰1600、1︰1600和1︰3200,小鼠腹水效价分别为1︰1×106、1︰4×106、1︰2×105,同时利用猪瘟高免血清IgG,用无感染猪、兔组织及其血清Ig作阴性对照进行的夹心ELISA检测表明,三株单抗均能够捕获猪瘟病毒,而不与正常的猪、兔脾淋组织及其血清Ig发生交叉反应。本研究建立了能够稳定分泌表达Erns蛋白的重组毕赤酵母系Erns-pPIC9K -GS115,获得了大量纯化的Erns蛋白,免疫原性良好;初步建立了利用Erns蛋白检测猪瘟抗体的间接ELISA方法,确定了抗原包被最佳浓度与对照血清最佳稀释度分别是4μg/ml和1︰400;获得了三株特异性分泌Erns蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞上清效价达到1︰1600以上,腹水效价1︰2×105以上。为猪瘟病毒的监测、诊断及病原学研究提供了物质条件。
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全文目录
摘要 3-4 Summary 4-7 第一章 绪论 7-16 1 CSFV 的研究现状 7-11 1.1 CSFV 的结构及特性 7-8 1.2 CSFV 基因组及编码蛋白 8 1.3 流行病学 8-9 1.4 猪瘟的实验室诊断 9-10 1.5 猪瘟的防制 10-11 2 E~(rns) 蛋白的研究现状 11-13 2.1 E~(rns) 蛋白的结构 11 2.2 E~(rns) 蛋白的抗原性 11-12 2.3 E~(rns) 蛋白的RNase 活性 12-13 3 猪瘟单克隆抗体应用研究进展 13-14 3.1 猪瘟单克隆抗体在猪瘟鉴别诊断方面的应用 13 3.2 猪瘟单克隆抗体在猪瘟病毒结构研究中的应用 13-14 4 毕赤酵母外源基因表达系统特点 14 5 表达的载体pPIC9K 14-15 6 研究目的和意义 15-16 第二章 E~(rns)蛋白在毕赤酵母中的表达以及间接ELISA 检测方法的建立 16-31 1 实验材料 16-17 1.1 质粒、菌株 16 1.2 生化试剂 16 1.3 酶类及核酸、蛋白Marker 16-17 1.4 检测血清 17 1.5 主要培养基及溶液 17 2 实验方法 17-24 2.1 重组表达载体E~(rns)-pPIC9K 的构建 17-18 2.2 转化大肠杆菌JM109(E.coli) 感受态细胞 18-20 2.3 酵母的转化与鉴定 20-21 2.4 重组表达载体E~(rns)-pPIC9K 在毕赤酵母中的表达及表达产物的检测 21-23 2.5 间接ELISA 检测E~(rns) 抗体方法的建立 23-24 3 结果 24-29 3.1 E~(rns) 基因扩增产物的鉴定 24 3.2 E~(rns)-pPIC9K 阳性重组质粒的筛选 24-26 3.3 E~(rns)-pPIC9K 重组酵母菌株的筛选及PCR 鉴定 26 3.4 E~(rns) 基因表达产物的SDS-PAGE 分析及Western-blot 检测 26-27 3.5 E~(rns) 蛋白表达分析 27 3.6 间接ELISA 检测方法的确定 27-29 4 讨论 29-31 4.1 表达系统 29-30 4.2 表达条件 30 4.3 关于间接ELISA 检测方法 30-31 第三章 E~(rns)蛋白单克隆抗体制备 31-40 1 实验材料 31-32 1.1 蛋白、细胞与病毒 31 1.2 实验动物 31 1.3 主要试剂和溶液 31-32 2 实验方法 32-36 2.1 动物免疫 32 2.2 免疫效价检测 32 2.3 细胞融合 32-33 2.4 杂交瘤细胞的选择培养 33 2.5 特异性抗体检测 33-34 2.6 杂交瘤细胞的克隆化 34 2.7 杂交瘤细胞的冻存 34 2.8 单克隆抗体的腹水制备 34-35 2.9 腹水的纯化(饱和硫酸铵沉淀法) 35 2.10 单克隆抗体特性鉴定 35-36 3 结果 36-38 3.1 小鼠免疫后血清抗体效价检测效果 36 3.2 杂交瘤细胞系的建立及部分特性鉴定结果 36-38 4 讨论 38-40 结论 40-41 参考文献 41-48 附录:主要试剂、溶液及培养基配制 48-51 致谢 51-52 作者简介 52-53 导师简介 53-54
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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