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AGEs对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及二甲双胍干预作用的研究

作　者: 周小智
导　师: 薛耀明
学　校: 南方医科大学
专　业: 内分泌与代谢病学
关键词: AGEs SW-480细胞细胞周期 CyclinD1 端粒酶活性二甲双胍
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

[背景]随着人民生活水平的提高、人口老龄化及生活方式的改变,糖尿病的患病率迅速增加。糖尿病可引起全身多系统、多器官的损害,导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织的病变,严重地影响了糖尿病患者的生活质量和生存率。近年来,研究还发现,糖尿病患者的恶性肿瘤如肝癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌等的发生率显著增加。研究报道恶性肿瘤居糖尿病患者全因死亡率的第二位,成为糖尿病患者的重要致死原因。结直肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤,其发病率在全部恶性肿瘤中居第四位。近年来,随着我国经济的快速发展和人民生活水平的提高,结直肠癌的发病率也在迅速增长。国内外的大量流行病学研究表明,糖尿病患者结直肠癌的发生率和死亡率较非糖尿病患者显著增加。因此,糖尿病与结直肠癌的关系及其机制越来越受到学者们的关注。目前,糖尿病患者高发结直肠癌的原因和机制尚不十分清楚,一般认为与高血糖、胰岛素抵抗和(或)高胰岛素血症等因素有关。近年来的研究显示晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)与恶性肿瘤的发生发展密切相关,可能也是糖尿病患者高发结直肠癌的重要发病机制之一。早在1993年,IKI等研究发现AGEs可以诱导生长因子IL-6的产生促进肾细胞癌细胞的生长,并认为AGEs可能是糖尿病患者高发肾细胞癌的重要原因和发病机制。Abe等研究亦发现AGEs可以促进人黑色素瘤细胞株G361和A375的生长和转移,并将黑色素瘤接种到裸鼠,发现黑色素瘤区AGEs的表达水平显著高于正常皮肤,而用AGEs受体拮抗剂可以抑制其生长并阻断其向肺部转移,能够延长裸鼠的生存期。AGEs是蛋白质或脂质经过非酶性糖基化反应的终产物。正常人体内非酶性糖基化反应进行得非常缓慢,AGEs生成量很少。糖尿病患者由于机体长期处于高血糖状态,非酶性糖基化反应加速,AGEs积聚于各种组织。晚期糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)是AGEs的最具特征和最重要的受体。在高血糖、氧化应激等特殊环境下,细胞表面的RAGE的表达明显增高。另外,近年来在胃癌、结直肠癌等许多恶性肿瘤中也可发现RAGE的表达增高。研究证实AGEs-RAGE相互作用在糖尿病的慢性并发症的发生和发展中起着很重要的作用。近年来的研究发现AGEs-RAGE系统除了与糖尿病慢性并发症密切相关外,还与恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系。Abe等认为AGEs-RAGE系统可能是糖尿病患者恶性肿瘤的发病率增加的重要发病机制。AGEs通过与RAGE相互作用促进氧化应激的产生,导致DNA损伤,而氧化应激反过来又进一步促进AGEs的形成和RAGE的表达,形成恶性循环从而促进恶性肿瘤的发生和发展。另外,AGEs-RAGE介导的活性氧簇的增多可以激活多条与细胞增殖和凋亡相关的信号通路,从而参与恶性肿瘤的发生和发展。Sebekova等亦认为AGEs可能通过与RAGE相互作用促进了终末期肾病患者恶性肿瘤的发生。目前,AGEs/AGEs-RAGE在糖尿病慢性并发症中的作用研究比较透彻,但在肿瘤细胞上的作用及其机制尚未完全阐明,有待于进一步的深入研究。探讨AGEs在肿瘤细胞中的作用对糖尿病患者防治恶性肿瘤具有重要的意义。近年来,糖尿病的治疗与恶性肿瘤的关系受到内分泌界的广泛关注。最近的流行病学研究表明,二甲双胍作为一种胰岛素增敏剂除了能降低血糖外,还具有抑制肿瘤的作用,能降低糖尿病患者的肿瘤风险,因此受到越来越多学者们的关注。二甲双胍是2型糖尿病的一线用药,主要是通过AMPK信号转导通路抑制肝糖产生和输出,促进外周组织摄取利用葡萄糖,抑制脂肪分解,减轻胰岛素抵抗来降低血糖。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)信号转导通路是组织细胞中重要的能量代谢调节通路之一,对于维持组织细胞内AMP/ATP的比例,调控蛋白与脂肪的合成与分解,以及细胞的应激均有重要的作用。近年来研究发现AMPK信号通路还参与了对肿瘤细胞增殖和凋亡过程的调控。现已证实,当AMPK处于磷酸化激活状态时,可以引起细胞内p53-p21途径的激活,进而阻滞细胞周期进程；同时,活化的AMPK还可以通过抑制mTOR信号转导通路抑制肿瘤细胞的生长。因此,二甲双胍除了具有降糖的作用外,可能通过AMPK信号通路发挥抗癌作用。目前,二甲双胍抑制肿瘤的作用机制尚未完全阐明,因此有必要作进一步的研究。有研究表明,二甲双胍除了激活AMPK信号通路外,还能抑制AGEs的形成,阻断AGEs与受体相互作用介导的一系列信号通路。Schurman等通过体外实验发现二甲双胍的干预能消除AGEs介导的对成骨细胞的有害作用。那么,二甲双胍的干预是否还能逆转AGEs诱导的促肿瘤细胞生长作用呢?目前,AGEs及二甲双胍在结肠癌细胞上的研究较少。因此,本研究将以人结肠癌细胞株SW-480为模型,探讨AGEs和二甲双胍对SW-480细胞增殖的影响及其机制,并进一步评估二甲双胍的干预作用对AGEs在SW-480细胞上的作用的影响。本研究包括以下三部分：第一章AGEs对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及其机制的研究[目的]探讨AGEs对人结肠癌细胞株SW-480增殖的影响及其作用机制。【研究对象和方法】1.以人结肠癌细胞株SW-480细胞为实验对象；SW-480细胞培养于37℃、5%C02、含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640完全培养基中,隔天传代1次。2.体外制备AGE修饰牛血清白蛋白(AGE-BSA)和BSA:将BSA与葡萄糖或PBS混合后于37℃孵育60天,4℃透析24h以去除未结合的葡萄糖。体外制备的AGE-BSA经荧光分光光度计鉴定,AGEs含量为102.67U/mg蛋白,BSA对照为12.84U/mg。3. MTT测细胞活力：取生长对数期的细胞消化成单细胞,接种至96孔培养板,培养液100ul/孔。细胞贴壁后以无血清培养基培养24 h后,设置空白对照组,BSA对照组和AGE组(分3组,AGE-BSA终浓度分别为50、100、500ug/ml),每组4复孔,加入相应培养液,72h后加MTT孵育4h,然后去上清,加DMSO振荡10分钟后酶标仪上测各孔490nm处吸光值(OD值)。4.流式细胞术测细胞周期：收取BSA对照组及100ug/mlAGE组干预72h后的细胞,PBS洗两遍,予预冷的70%酒精4℃固定过夜,用PBS洗两遍,离心弃PBS,加入PI染液(碘化丙啶及RNase A终浓度均为50ug/ml)避光染色30min,流式细胞仪检测进行细胞周期分析,比较G0/G1, S期和G2/M期的差异。5.Western blotting测定CyclinD1的表达：收取BSA对照组及100ug/mlAGE组干预72h后的细胞。进行常规细胞裂解获取蛋白后,与预染蛋白marker一起上样,经浓缩胶和分离胶进行SDS-PAGE电离,完毕后将蛋白质电转印到PVDF膜上,将膜放入含50g/L脱脂奶粉的TBST中常温封闭2h,然后与一抗(CyclinD1一抗购自北京博奥森生物技术有限公司)按1：250的比例4℃孵育过夜,用TBST液洗膜3次,每次5(?)nin,PVDF膜再分别与辣根过氧化物酶标记的相应的二抗(1：5000)室温孵育1h后,用TBST液洗膜3次,每次5 min。用ECL显色试剂盒显示目的条带,扫描后用Quantity One软件分析条带。6.用TRAP银染法测定AGEs对端粒酶活性的影响：根据端粒酶活性试剂盒检测说明书提取BSA对照组及100ug/mlAGE组干预72h后的端粒酶。吸取5μL10×TRAP buffer,另加入1μL dNTPs, 1μL Taq-DNA polymerase, 1μL TS primer,2μL端粒酶提取物,然后加入39μL灭菌超纯水,于PCR扩增仪上23℃保温30min,加入1μL CX primer,混匀,在扩增仪上进行36个循环,循环参数94℃,30s; 50℃,30s; 72℃,90s;最后72℃延伸10min。取9ulPCR扩增产物加上1ul上样缓冲液混匀后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳至溴酚蓝跑到凝胶底部为止,取出凝胶进行银染。拍照后用Quantity One软件进行条带分析。7.数据均以均数±标准差表示,应用SPSS13.0软件进行统计分析。多组数据间的比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),若方差不齐采用Welch近似方差分析；多重比较采用LSD法(Least-significant difference test),如果方差不齐采用Dunnett’s T3检验。两组数据间的比较采用两独立样本t检验。P<0.05(双侧)为差异有显著性。【结果】1.细胞活力的比较：BSA组(0.729±0.083)、50ug/ml AGE组(1.042±0.178)、100ug/ml AGE组(1.440±0.242)及500ug/mlAGE组(1.845±0.489)之间存在显著性差异(F=50.280,P=0.000), AGEs可以促进人结肠癌细胞SW-480的增殖，呈剂量依赖性。2.细胞周期的比较：BSA组及100ug/mlAGE组干预72h后G0/G1期细胞百分率分别为56.02±0.58,51.93±1.01,有显著性差异(t=6.109,P=0.004); S期细胞百分率分别为31.86±3.27,34.32±4.06,差异无统计学意义(t=-0.818,P=0.459); G2/M期细胞百分率分别为12.13±2.83,13.76±4.07,差异无统计学意义(t=-0.568,P=0.600)。3. CyclinD1的表达：Western blotting示,100ug/mlAGE组(1.27±0.04)干预72小时后CyclinD1表达显著强于BSA对照组(0.74±0.04)(t=-17.436,P=0.000)。4.端粒酶活性的比较：TRAP银染法检测端粒酶活性示,100ug/mlAGE组(35.51±0.57)72小时后端粒酶活性显著强于BSA对照组(28.91±0.34) (t=-17.364,P=0.000)。[结论]1. AGEs可以促进人结肠癌细胞SW-480的增殖,呈剂量依赖性。2. AGEs促进SW-480细胞生长的作用机制可能与其上调CyclinD1的表达诱导细胞周期紊乱和增加端粒酶活性有关。第二章二甲双胍对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及其机制的研究[目的]探讨二甲双胍对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及其作用机制。[研究对象和方法]1.以SW-480为实验对象,培养方法同前；2.以PBS溶解盐酸二甲双胍粉末,对照组加入同等量的PBS；3. MTT实验分为PBS组,1、5、10mmol/L二甲双胍组；其余实验分为PBS组和5mmol/L二甲双胍组(MET组)。4.MTT法测细胞生长曲线,细胞周期检测,CyclinD1的检测,端粒酶活性检测方法同第一章；5.数据均以均数±标准差表示,应用SPSS13.0软件进行统计分析。多组数据间的比较采用One-way ANOVA,若方差不齐采用Welch近似方差分析；多重比较采用LSD法,如果方差不齐采用Dunnett’s T3检验。两组数据间的比较采用两独立样本t检验。P＜0.05(双侧)为差异有显著性。[结果]1.生长曲线的比较：二甲双胍可以抑制人结肠癌细胞SW-480的增殖,呈时间剂量依赖性。1mmol/L二甲双胍组干预三天后生长速度开始显著慢于正常对照组(P<0.05)。5mmol/L及10mmol/L二甲双胍组在干预24h后生长速度开始显著慢于正常对照组(P＜0.05)。2.细胞周期的比较：PBS组及5mmol/L二甲双胍干预72h后G0/G1期细胞百分率分别为55.81±0.63，63.38±0.99,有显著性差异(P=0.000); S期细胞细胞百分率分别为31.11±3.05,25.29±1.64,差异有统计学意义(P=0.023);G2/M期细胞百分率分别为13.09±3.00,11.33±2.60,差异无统计学意义(P=0.412)。3. CyclinD1的表达：Western blotting示,5mmol/L二甲双胍组(0.68±0.06)干预72小时后CyclinD1表达显著弱于PBS对照组(0.89±0.04)(P=0.001)。4.端粒酶活性的比较：TRAP银染法检测端粒酶活性示,二甲双胍干预组(47.52±0.06)72小时后端粒酶活性显著弱于PBS对照组(52.48±0.06)(P=0.000)。[结论]1.二甲双胍可以抑制人结肠癌细胞SW-480的增殖,呈时间剂量依赖性。2.二甲双胍抑制SW-480细胞生长的作用机制可能与其下调CyclinD1的表达使细胞周期G0/G1期阻滞和抑制端粒酶活性有关。第三章二甲双胍对AGEs诱导的SW-480细胞增殖作用的影响及其机制的研究[目的]探讨二甲双胍对AGEs诱导的人结肠癌细胞SW-480增殖作用的影响及其作用机制。【研究对象和方法】1.以SW-480为实验对象,培养方法同前；2. AGE-BSA、BSA制备及二甲双胍(MET)配制同前。3.实验分为三组,BSA组,100ug/mlAGE组,及100ug/ml AGE+5mmol/L MET组(A+M组),每组同时干预72小时；4. MTT检测细胞活力,细胞周期检测,CyclinD1的检测,端粒酶活性检测方法同第一章；5.实验数据采用平均数±标准差(x±s)表示,各组内均数比较采用One-way ANOVA,若方差不齐采用Welch近似方差分析；多重比较采用LSD法,如果方差不齐采用Dunnett’s T3检验。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。【结果】1.细胞活力的测定：三组间的细胞活力存在显著性差异(F=46.012 P=0.000)BSA组、100 ug/mlAGE组、100 ug/mlAGE+5mmol/L MET组的OD值分别为0.726±0.089,1.148±0.187,0.565±0.047。其中100ug/mlAGE组较BSA组相比细胞活力显著增加(P=0.000),100ug/mlAGE+5mmol/L MET组与100ug/mlAGE组相比细胞活力显著下降(P=0.000)。2.细胞周期的测定：BSA组、100 ug/mlAGE组、100 ug/ml AGE+5mmol/LMET组培养72h后G0/G1期所占百分比分别为55.98±0.92,52.28±1.09,57.08±0.22,三组间存在显著性差异(F=36.581 P=0.000),其中100 ug/mlAGE组与BSA组相比G0/G1期比率显著减少(P=0.000),100 ug/ml AGE +5mmol/L MET组与100 ug/ml AGE组相比G0/G1期百分率显著增加(P=0.000);S期所占百分比分别为31.22±2.92,33.91±3.41,31.51±4.34,三组间差异无统计学意义(F=0.671 P=0.535);G2/M期所占百分数分别为13.09±3.00,14.81±3.33,11.42±4.12,三组间差异无统计学意义(F=0.488P=0.629)。3.CyclinD1的表达：三组之间存在显著性差异(F=72.875 P=0.000)。BSA组、100ug/mlAGE组、100 ug/mlAGE+5mmol/L MET组Cyclin D1的表达量分别为1.12±0.05,1.58±0.04,1.23±0.06。其中AGE组与BSA组相比CyclinD1的表达显著增强(P=0.000), AGE+MET组与AGE组相比显著减弱(P=0.000)。4.端粒酶活性的测定：BSA组、100 ug/mlAGE组、100 ug/mlAGE+5mmol/L MET组端粒酶活性分别为33.39±0.62,35.61±0.51,31.01±1.12,三组之间有显著性差异(F=25.028 P=0.001),其中AGE组与BSA组相比端粒酶活性显著增加(P=0.014),AGE+MET组与AGE组相比显著减弱(P=0.000)。【结论】1.二甲双胍可以抑制AGEs所诱导的促人结肠癌细胞SW-480生长作用。2.二甲双胍抑制AGEs诱导的SW-480生长作用的机制可能与其下调CyclinD1的表达纠正AGEs诱导的细胞周期紊乱和抑制AGEs诱导的促端粒酶活性作用有关。

全文目录

摘要  3-12
ABSTRACT  12-25
前言  25-30
第一章 AGEs对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及其机制的研究  30-49
  1.1 材料和方法  30-42
  1.2 实验结果  42-45
  1.3 讨论  45-49
第二章二甲双胍对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及其机制的研究  49-58
  2.1 材料和方法  49-50
  2.2 实验结果  50-54
  2.3 讨论  54-58
第三章二甲双胍对AGEs诱导的SW-480细胞增殖作用的影响及其机制的研究  58-65
  3.1 实验材料和方法  58-59
  3.2 实验结果  59-62
  3.3 讨论  62-65
全文小结  65-66
参考文献  66-72
附录  72-73
致谢  73-76
统计学证明  76

AGEs对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及二甲双胍干预作用的研究

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