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稻瘟病菌中3个与Rho1互作蛋白的功能分析

作　者: 余杰
导　师: 王宗华
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 稻瘟病菌 Rho1互作蛋白 酵母双杂交 基因功能分析
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 31次
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内容摘要


Rho族蛋白作为Ras超家族蛋白的最主要成员之一,在真菌中普遍存在,且在其生长发育中行使着重要功能。Rho1在Rho族蛋白中占据着重要的地位,为了解Rho1在稻瘟病菌中的信号网络,本研究针对稻瘟病菌中与Rho1互作的3个蛋白进行了功能分析。根据生物信息学预测, MoAca（Mgg13499）、MoCnd（Mgg00256）、MoPnrs（Mgg09953）均与Rho1（Mgg07176）互作,本研究通过酵母双杂交实验,验证明确了这些基因与Rho1的互作关系。研究还通过同源重组的原理逐一获得了这些基因的敲除突变体以及MoCnd和MoPnrs的过量表达突变体,并观察这些突变体的表型如生长速度、产孢量、孢子萌发率及致病性的变化。研究结果表明,与野生型菌株相比,敲除突变体△MoAca的生长速度明显减慢,并且其生长极性也受到相应的影响,接种实验表明其致病能力也有减弱的现象。敲除突变体△MoPnrs在生长速度,萌发率等表型方面较野生型均没有明显的变化,但其产孢量明显减少,并且其过量表达突变体的产孢量有增加的现象。敲除突变体△MoCnd的敲除突变体和过量表达突变体的表型较野生型均无显著的改变。综上,稻瘟病菌中与Rho1互作的部分蛋白影响着稻瘟病菌的营养生长、致病性及产孢。

全文目录


摘要  9-10
Abstract  10-11
1 前言  11-18
  1.1 Rho1 及其功能  11-13
    1.1.1 Rho 族蛋白及功能  11-12
    1.1.2 Rho1 及其研究进展  12-13
  1.2 与Rho1 互作蛋白的研究分析  13-14
  1.3 能量代谢途径在稻瘟病菌中的研究意义  14-15
  1.4 泛素化在真菌生物中的研究  15-17
  1.5 蛋白质水解在稻瘟病菌中的研究进展  17-18
2 材料与方法  18-30
  2.1 实验材料  18-19
    2.1.1 实验用载体  18
    2.1.2 实验用菌株  18
    2.1.3 实验植物材料  18
    2.1.4 培养基  18-19
    2.1.5 生化试剂  19
  2.2 实验方法  19-30
    2.2.1 生物信息学分析  19-20
    2.2.2 AD（prey）载体的构建  20-21
    2.2.3 BD（bait）载体的构建  21-22
    2.2.4 酵母感受态细胞的制备  22
    2.2.5 酵母转化  22-23
    2.2.6 稻瘟病菌菌丝体基因组DNA 的提取  23
    2.2.7 稻瘟病菌菌丝体总RNA 的提取  23-24
    2.2.8 PCR  24-25
    2.2.9 反转录PCR  25
    2.2.10 敲除突变体载体的构建  25-27
    2.2.11 过量表达突变体载体的构建  27
    2.2.12 原生质体的制备  27-28
    2.2.13 原生质体转化  28-29
    2.2.14 稻瘟菌生长速度的测定  29
    2.2.15 产孢量的统计  29
    2.2.16 孢子的萌发及附着胞的形成实验  29
    2.2.17 洋葱表皮侵染观察实验  29
    2.2.18 大麦的接种实验  29
    2.2.19 水稻致病性分析  29-30
3 结果与分析  30-61
  3.1 酵母双杂交验证所研究蛋白与Rho1 的互作关系  30-34
    3.1.1 生物信息学分析  30
      3.1.1.1 MPID 分析预测所研究的蛋白与Rho1 的互作关系  30
    3.1.2 AD 载体的构建  30-31
    3.1.3 BD 载体的构建  31
    3.1.4 Rho1 诱饵载体自身激活活性检测  31-32
    3.1.5 酵母共转化及转化子的筛选、验证  32-34
  3.2 MoAca 的功能分析  34-41
    3.2.1 MoAca 的生物信息学分析  34-36
    3.2.2 MoAca 相关突变体分析  36-41
      3.2.2.1 MoAca 的敲除突变体的获得  36-37
        3.2.2.1.1 MoAca 敲除载体的构建  36
        3.2.2.1.2 MoAca 敲除转化子的筛选与鉴定  36-37
      3.2.2.2 MoAca 敲除突变体的表型分析  37-41
        3.2.2.2.1 MoAca 的敲除导致稻瘟病菌生长缓慢且菌丝生长异常  37-39
        3.2.2.2.2 MoAca 的敲除并不影响稻瘟病菌的产孢量，孢子形态及萌发率  39
        3.2.2.2.3 MoAca 的敲除影响稻瘟病菌对寄主的侵染  39-41
  3.3 MoPnrs 的功能分析  41-51
    3.3.1 MoPnrs 的生物信息学分析  41-42
    3.3.2 MoPnrs 的敲除突变体功能分析  42-47
      3.3.2.1 MoPnrs 敲除突变体的获得  43-44
        3.3.2.1.1 MoPnrs 敲除载体的构建  43
        3.3.2.1.2 MoPnrs 敲除转化子的筛选与鉴定  43-44
      3.3.2.2 MoPnrs 敲除突变体的表型分析  44-47
        3.3.2.2.1 MoPnrs 基因的敲除并不影响稻瘟病菌生长发育  44-45
        3.3.2.2.2 MoPnrs基因的敲除影响稻瘟病菌的产孢量而并不影响孢子的形态及萌发率  45-47
        3.3.2.2.3 对MoPnrs 的敲除并不影响稻瘟病菌对水稻及大麦的致病性  47
    3.3.3 MoPnrs 过量表达突变体的分析  47-51
      3.3.3.1 MoPnrs 过量表达突变体的获得  47-49
        3.3.3.1.1 MoPnrs 过量表达载体的构建  47-48
        3.3.3.1.2 MoPnrs 过量表达转化子的筛选和验证  48-49
      3.3.3.2 MoPnrs 过量表达突变体的表型分析  49-51
        3.3.3.2.1 MoPnrs 在稻瘟病菌中的过量表达不影响稻瘟病菌菌丝的生长  49
        3.3.3.2.2 MoPnrs在稻瘟病菌中的过量表达致使稻瘟病菌的产孢量增加却不影响孢子的萌发和侵染  49-51
        3.3.3.2.3 MoPnrs 在稻瘟病菌中的过量表不影响稻瘟病菌的致病性  51
  3.4 MoCnd 的功能分析  51-61
    3.4.1 MoCnd 的生物信息学分析  51-53
    3.4.2 MoCnd 的敲除突变体功能分析  53-57
      3.4.2.1 MoCnd 敲除突变体的获得  53-54
        3.4.2.1.1 MoCnd 敲除载体的构建  53
        3.4.2.1.2 MoCnd 敲除转化子的筛选与鉴定  53-54
      3.4.2.2 MoCnd 敲除突变体的表型分析  54-57
        3.4.2.2.1 MoCnd 基因的敲除并不影响稻瘟病菌生长发育  54-55
        3.4.2.2.2 MoCnd 基因的敲除对到稻瘟病菌产孢量及萌发率的影响  55-56
        3.4.2.2.3 对MoCnd 的敲除并不影响稻瘟病菌对水稻及大麦的致病性  56-57
    3.4.3 MoCnd 过量表达突变体的分析  57-61
      3.4.3.1 MoCnd 过量表达突变体的获得  57-58
        3.4.3.1.1 MoCnd 过量表达载体的构建  57
        3.4.3.1.2 MoCnd 过量表达转化子的筛选和验证  57-58
      3.4.3.2 MoCnd 过量表达突变体的表型分析  58-61
        3.4.3.2.1 MoCnd 在稻瘟病菌中的过量表达不影响稻瘟病菌菌丝的生长  58
        3.4.3.2.2 MoCnd 在稻瘟病菌中的过量表达致使稻瘟病菌的产孢量增加却不影响孢子的萌发和侵染  58-59
        3.4.3.2.3 MoCnd 在稻瘟病菌中的过量表达不影响稻瘟病菌的致病性  59-61
4 讨论  61-64
  4.1 初步明确 MoAca、MoPnrs、MoCnd 与 Rho1是互作蛋白。  61
  4.2 MoAca、MoPnrs、MoCnd 参与着Rho1 激活态所调节的下游多种信号通路  61
  4.3 MoAca 与Rho1 可能共同作用调节稻瘟病菌气生菌丝的生长及致病性  61-62
  4.4 在稻瘟菌中的蛋白质降解与产孢之间的关系  62-64
参考文献  64-70
附录1 本研究所用的PCR 引物序列及其相关用途  70-72
致谢  72

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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