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GATA3-NFAT1相互作用在人T细胞IL-13基因表达中的研究

作 者: 杨妍
导 师: 黄茂
学 校: 南京医科大学
专 业: 呼吸内科
关键词: GATA-3 RNA干扰 基因表达 GATA3 NFAT1 IL-13 GATA3-siRNA 基因转录 糖皮质激素
分类号: R562.25
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


GATA3-NFAT1相互作用在人T细胞IL-13基因表达中作用的研究支气管哮喘是一种严重危害人民身体健康的常见病、多发病,近年来,该病发病率在全球范围内呈上升趋势。目前认为,支气管哮喘是以气道狭窄、高反应性和气道炎症为特征的一组综合征,气道的炎症是前两者的基础。在多种遗传和环境因素共同作用下,经过巨噬细胞(包括树突状细胞)的抗原呈递作用,Na?ve T辅助细胞(Th 0)被活化,分化为Th 2细胞,释放IL-4、IL-5、IL-13等多种Th 2细胞因子,促进了支气管哮喘的形成和发展。其中,IL-13几乎参加了所有哮喘表型(如气道炎症、气道高反应性,粘液高分泌以及气道重建等)的形成,成为支气管哮喘发病机制中的重要炎症介质。但迄今为止,对IL-13基因表达的分子调控机制仍知之甚少。T细胞是产生IL-13的主要来源。CD3/CD28双信号通路对T细胞的刺激能够模拟T细胞在体内受抗原活化产生Th2细胞因子的过程。转录因子在基因的表达和调控上具有核心作用,GATA3是Th2细胞特异性的转录因子,细胞中增高的GATA3能够同时促进Th2细胞中IL-4、IL-5和IL-13的基因表达。许多研究表明在IL-13基因启动子区域GATA位点对IL-13的基因表达起重要作用。活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)是TCR介导的信号转导通路中关键的转录因子。我们的前期研究表明在CD3/CD28双信号通路刺激后NFAT1与IL-13启动子结合增强。在人IL-13基因启动子区域GATA3与NFAT1位点邻近,作为同时参与IL-13基因转录的GATA3和NFAT1间是否存在相互作用?如何相互作用?均值得进一步探讨。本课题就GATA-3和NFAT1在T细胞系(Hut-78细胞)CD3/CD28双信号通路共刺激下产生IL-13过程中的作用进行相关研究,并就糖皮质激素丙酸氟替卡松(Fluticasone propionate, FP)对GATA3的作用进行探讨。第一部分:RNA干扰抑制T细胞转录因子GATA-3的表达目的:应用化学合成siRNA转染T细胞,通过流式细胞仪检测转染效率,并检测转染对转录因子GATA-3的干扰效果。方法:应用FAM- Negative siRNA转染HUT-78细胞,转染后6h应用流式细胞仪评估其转染效率;GATA-3 siRNA转染后48小时应用Western blot和实时荧光定量PCR分别检测siRNA的干扰效果。结果:RNA干扰后,Western blot结果显示HUT-78细胞的GATA-3蛋白表达量明显减少(P < 0.05)。实时荧光定量PCR结果与Western blot结果一致。结论:化学合成的siRNA可以成功转染HUT-78细胞,并能有效抑制转录因子GATA-3的表达。第二部分:GATA3-siRNA对T细胞IL-13基因表达的影响目的:研究T细胞在CD3/CD28双信号通路刺激后IL-13的基因表达以及GATA3-siRNA对该基因表达的影响以及GATA3-siRNA对NFAT1与IL-13启动子结合的影响,探讨GATA3和NFAT1之间相互作用调节IL-13基因表达的可能机制。方法:采用CD3/CD28单克隆抗体(浓度分别为10μg/ml和5μg/ml)双信号通路对Hut-78细胞进行共刺激,分别在6h、19h时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法观察IL-13基因表达。通过染色质免疫共沉淀(CHIP)的方法研究GATA3被GATA3-siRNA干扰后NFAT1与IL-13启动子区域的结合情况。结果:Hut-78细胞在CD3/CD28共刺激活化后,细胞内IL-13mRNA表达在6小时即明显增高,在第19小时,仍有进一步增高的趋势。GATA3-siRNA在6h,19h均能抑制IL-13mRNA的表达,以19h抑制更明显(7.54±3.16VS1.85±1.04),P<0.05。siRNA对GATA3干扰后,NFAT1与IL-13启动子区域结合减弱。T细胞经CD3/CD28免疫共刺激活化30分钟时GATA3-siRNA能够抑制NFAT1与IL-13启动子结合(5.57±0.44VS0.87±0.64 ),而在1h,2h时抑制NFAT1与IL-13启动子结合的作用不明显。结论:GATA3-siRNA能抑制IL-13基因表达,并抑制NFAT1与IL-13启动子区域结合。NFAT1与IL-13启动子区域的结合可能部分需要GATA3参与。第三部分:FP抑制活化T细胞IL-13基因表达的机制目的:研究T细胞在CD3/CD28共刺激活化后,FP对IL-13基因表达的影响及GATA3与IL-13启动子结合的影响,探讨FP对活化T细胞中IL-13基因表达调节的可能机制。方法:采用CD3/CD28单克隆抗体(浓度分别为10μg/ml和5μg/ml)双信号通路对Hut-78细胞进行共刺激,分别在6h,19h观察Hut-78细胞内IL-13mRNA以及GATA3表达情况。通过染色质免疫共沉淀(CHIP)的方法研究FP对GATA3与IL-13启动子结合的影响。结果:Hut-78细胞在CD3/CD28共刺激活化后,细胞内IL-13mRNA表达在6小时即明显增高,在第19小时,仍有进一步增高的趋势。高浓度的FP(1×10-8M)能够抑制CD3/CD28作用下IL-13mRNA的表达6h(9.13±1.46VS5.9±1.75),19h(11.07±1.67VS1.87±1.33)(P<0.05)。高浓度的FP(10-8M)未改变GATA-3mRNA的表达水平。Hut-78细胞经CD3/CD28双信号通路共刺激活化后在30min、1h及2h各时间点GATA-3与IL-13启动子区域结合逐渐增强。FP在细胞活化1h能显著抑制GATA3与IL-13启动子区域结合(8.19±2.18 VS 2.69±1.33),P<0.05。结论:T细胞经过CD3/CD28活化后IL-13mRNA表达增加,并促进GATA3与IL-13启动子区域结合。FP不能改变细胞内GATA3 mRNA总量提示糖皮质激素并不是通过抑制GATA-3基因转录抑制IL-13等Th2细胞因子的转录,而可能通过其他途径影响GATA3与启动子区域结合,抑制T细胞IL-13基因表达。

全文目录


中英文对照表  4-5
中文摘要  5-9
英文摘要  9-12
第一部分:RNA 干扰抑制T 细胞转录因子GATA-3 的表达  12-24
  一.引言  12-13
  二.材料和方法  13-17
  三.结果  17-19
  四.讨论  19-21
  小结  21
  参考文献  21-24
第二部分 GATA3-siRNA 对T 细胞IL-13 基因表达的影响  24-39
  一.引言  24-25
  二.材料和方法  25-30
  三.结果  30-32
  四.讨论  32-35
  小结  35
  参考文献  35-39
第三部分 FP 抑制活化T 细胞IL-13 基因表达的机制  39-52
  一.引言  39-44
  二.材料和方法  44
  三.结果  44-48
  四.讨论  48-50
  小结  50
  参考文献  50-52
研究总结  52-53
综述(一)  53-61
  参考文献  58-61
在读期间发表文章  61-62
论著  62-68
致谢  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 气管和支气管疾病 > 支气管疾病 > 支气管哮喘
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