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米黑根毛霉脂肪酶基因在曲霉中的表达研究

作　者: 崔翠
导　师: 潘力
学　校: 华南理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 米曲霉IFO4177 泡盛曲霉CBS115.52 脂肪酶转化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

丝状真菌有生产和分泌外源蛋白的巨大潜力,随着研究的不断深入,其蛋白表达的一些重要特性已逐渐被人们所认识,包括表达量大、胞外分泌率高、蛋白质分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞、生产的外源蛋白具有天然活性等。米曲霉(Aspergillus. oryzae)和泡盛曲霉(Aspergillus. awamori)是工业上用于外源蛋白表达的重要生产菌株。丝状真菌作为宿主表达外源蛋白,尤其是非丝状真菌蛋白时,其分泌效率往往不尽如人意,产率一般比表达同源蛋白低2到3个数量级,另外,丝状真菌转化效率低也在一定程度上制约了其在工业上的应用。随着分子遗传技术的发展,可以利用基因工程方法对丝状真菌进行有目的的遗传改造,以提高外源蛋白的表达量。本研究首先进行了野生宿主菌抗性标记的筛选,研究了吡啶硫胺素(PT)对米曲霉IFO4177生长的影响以及潮霉素B对米曲霉IFO4177和泡盛曲霉CBS115.52生长的影响。结果表明,PT可以很大程度上抑制米曲霉的生长,可以利用PT抗性基因(ptrA)构建野生型米曲霉转化体系;潮霉素B对米曲霉有一定的抑制作用,而100μg/mL潮霉素B即可抑制泡盛曲霉的生长,因此可以利用潮霉素抗性基因构建转化体系。其次,构建了针对野生型米曲霉宿主的根癌农杆菌介导转化方法。以米曲霉IFO4177为例探讨丝状真菌的转化方法,包括原生质体转化和根癌农杆菌介导的丝状真菌转化。由于米曲霉一直没有找到合适的抗性标记,因此转化后筛选工作困难,未得到稳定遗传的转化子。对转化方法进行改进后,本研究以泡盛曲霉CBS115.52为例,建立根癌农杆菌介导的泡盛曲霉转化方法,将米黑根毛霉脂肪酶基因转入其中,从DNA、RNA和蛋白水平对转化子进行了检测,筛选到稳定遗传的转化子并对其表达的脂肪酶酶活进行了初步测定。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-12
第一章绪论  12-22
  1.1 丝状真菌表达系统  12-18
    1.1.1 宿主与筛选标记  13-14
    1.1.2 转化方法  14-17
    1.1.3 表达载体  17-18
  1.2 脂肪酶概述  18-20
    1.2.1 脂肪酶的酶学性质  18-19
    1.2.2 脂肪酶的应用  19-20
    1.2.3 国内外脂肪酶的研究进展  20
  1.3 课题来源与研究内容  20-21
    1.3.1 本课题来源  20
    1.3.2 本课题研究内容  20-21
  1.4 本课题研究意义  21-22
第二章野生型曲霉宿主菌的构建及快速筛选方法的建立  22-32
  2.1 引言  22-23
  2.2 实验材料  23-24
    2.2.1 主要仪器设备  23
    2.2.2 主要试剂及配方  23
    2.2.3 主要培养基配方  23-24
    2.2.4 菌种材料及质粒  24
  2.3 实验方法  24-26
    2.3.1 米曲霉 IFO4177 对吡啶硫胺素（PT）的耐受性  24
    2.3.2 米曲霉 IFO4177 对潮霉素 B 的耐受性  24
    2.3.3 泡盛曲霉 CBS115.52 对潮霉素 B 的耐受性  24
    2.3.4 菌落PCR 快速检测转化子方法建立  24-26
  2.4 结果与讨论  26-31
    2.4.1 吡啶硫胺素（PT）抗性宿主的筛选  26-27
    2.4.2 潮霉素（hygB）抗性宿主的筛选  27-28
    2.4.3 菌落PCR 快速检测方法的建立  28-31
  2.5 本章小结  31-32
第三章表达载体的构建及米曲霉的转化方法的探索  32-51
  3.1 引言  32-33
  3.2 实验材料  33-35
    3.2.1 主要试剂及配方  33
    3.2.2 实验仪器  33-34
    3.2.3 主要培养基  34
    3.2.4 主要菌种  34
    3.2.5 转化用质粒  34-35
  3.3 实验方法  35-41
    3.3.1 gateway 克隆技术构建pHGW-脂肪酶表达载体  35-36
    3.3.2 转化农杆菌  36-38
    3.3.3 米曲霉原生质体转化  38-40
    3.3.4 农杆菌介导的米曲霉转化  40-41
  3.4 结果与讨论  41-49
    3.4.1 农杆菌双元载体构建  41-43
    3.4.2 米曲霉原生质体制备结果  43-44
    3.4.3 米曲霉 IFO4177 共转化  44-46
    3.4.4 pPTR-脂肪酶质粒转化米曲霉 IFO4177  46-47
    3.4.5 米曲霉 IFO4177 线性载体转化  47-48
    3.4.6 农杆菌介导米曲霉转化结果  48-49
  3.5 本章小结  49-51
第四章根癌农杆菌介导的泡盛曲霉转化及转化子的鉴定  51-70
  4.1 引言  51
  4.2 实验材料  51-56
    4.2.1 主要试剂及配方  51-54
    4.2.2 实验仪器  54
    4.2.3 培养基  54-56
  4.3 实验方法  56-61
    4.3.1 农杆菌介导的泡盛曲霉转化  56
    4.3.2 菌落PCR 检测转化子  56
    4.3.3 基因组提取  56-57
    4.3.4 PCR 检测目的基因  57-58
    4.3.5 RT-PCR 检测目的基因的表达  58
    4.3.6 胞外蛋白提取及蛋白电泳  58-60
    4.3.7 Western blot 检测目的蛋白  60
    4.3.8 脂肪酶活力测定  60-61
  4.4 结果与讨论  61-69
    4.4.1 农杆菌介导泡盛曲霉转化结果  61-62
    4.4.2 PCR 检测目的基因结果及测序结果  62-66
    4.4.3 荧光定量PCR 检测结果  66-67
    4.4.4 蛋白电泳和Western blot 检测目的蛋白  67-68
    4.4.5 脂肪酶活力测定结果  68-69
  4.5 本章小结  69-70
结论与展望  70-72
参考文献  72-77
攻读学位期间发表的学术论文  77-78
致谢  78

米黑根毛霉脂肪酶基因在曲霉中的表达研究

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