学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

肺炎克雷伯菌可移动基因组的研究

作　者: 刘平磊
导　师: 欧竑宇
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物工程
关键词: 肺炎克雷伯菌可移动基因组基因组岛定向克隆碳青霉烯酶多重耐药性
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 65次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

革兰氏阴性肠杆菌科肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是医源性感染最重要的条件致病菌之一。随着抗菌素的泛用,多重耐药性正在它们中广泛传播,给临床抗感染治疗带来极大的困扰。研究发现许多与致病和耐药等相关的基因,可借助接合性质粒、插入序列元件、整合子和基因组岛(Genmomic islands)等可移动遗传元件进行广泛传播,这些可移动遗传元件组成了可移动基因组(mobile genome, or ?mobilome·)。其中,基因组岛在细菌的进化机制、致病机理和抗菌素抗性中扮演着重要的角色。目前,基因组岛已在多种肠杆菌科细菌中发现和报道,但对于K. pneumoniae基因组岛的研究却鲜有报道。本研究通过采用生物信息学工具MobilomeFINDER,对4株已测序K. pneumoniae基因组(MGH 78578, NTUH-K2044, Kp342 and KCTC2242)中的87个tRNA/tmRNA基因位点进行分析,共识别出8个tRNA/tmRNA基因作为外源DNA片段的插入热点。采用tRIP-PCR策略考察了36株环境和临床分离的K. pneumoniae菌株在这8个插入热点中基因组岛的分布情况,揭示了在不同生态环境下K. pneumoniae的遗传多样性。通过构建3个位点特异的酵母捕捉载体,并利用酵母同源重组系统成功克隆6个新岛(9~36 kb),实现了精确定向克隆K. pneumoniae染色体中大片段DNA的方法,为进一步克隆其它临床和环境菌株基因组岛奠定了基础。同时,本研究对克隆的两个插入到tmRNA基因位点的新岛tmGI_Kpw49和tmGI_Kp35进行了初步的序列和功能分析。从水稻根际分离的K. pneumoniae w49中的一个9.6 kb岛tmGI_Kpw49,生物信息学预测其涉及L-艾杜糖酸(L-idonate)的分解代谢,该代谢岛可能在w49菌株和植物的共生过程中扮演着重要的角色。从病人伤口分泌物中分离的K. pneumoniae HS04035中的一个36.6 kb岛tmGI_Kp35,编码一个整合到宿主染色体上的P2-like噬菌体。序列比对发现该类型噬菌体整合在多种已测序肠杆菌科细菌的染色体上。通过文献收集和生物信息学预测,系统地比较分析了已知和预测的P2-like噬菌体,发现该类型噬菌体,除含有保守的结构基因外,常携带编码致病因子等重要的特异性基因,表明其在肠杆菌科细菌的致病和遗传多样性上扮演着重要的角色。基于36株环境和临床分离的K. pneumoniae菌株的tRIP-PCR筛查结果,本研究对一株临床分离的泛耐药K. pneumoniae HS11286菌株进行了全基因组测序。HS11286菌株是2011年初从华山医院一病人的痰液中分离的,具有广谱的耐药性,属于碳青霉烯酶产生菌。通过454测序、拼装和补gaps,获得了7个环形的复制子,包含一条染色体和六个质粒。HS11286染色体大小为5,333,942 bp,GC含量为57.5 %,注释出5316个蛋白编码基因,87个tRNA基因,1个tmRNA基因和8套rRNA操纵子(16S-23S-5S)。通过与已测序的4株K. pneumoniae的模拟消减杂交分析,共识别出422个HS11286菌株特异的基因。进一步在HS11286基因组中识别出9个基因组岛,其中7个为前噬菌体,另外2个为整合性接合元件。HS11286菌株中含有6个天然质粒,包括3个为耐药性质粒(～110 kb),和3个大小为1～4 kb的小质粒。质粒pKPHS1推测为致病相关的整合型质粒,同时编码β内酰胺酶CTX-M-14。质粒pKPHS2和pKPHS3均为多重抗性质粒,前者携带编码碳青霉烯酶基因blaKPC-2,是碳青霉烯类药物耐药的主要机制;而后者携带约10种重要的抗性基因。同时,两者都携带接合转移相关的tra基因,可能导致耐药基因在不同细菌中的转播。3个小质粒pKPHS4、pKPHS5和pKPHS6编码功能未知的蛋白,其中,1.3 kb的质粒pKPHS6是目前肺炎克雷伯中报道的最小质粒。多重耐药革兰氏阴性条件致病菌已成为近年细菌学研究的热点之一。本研究以K. pneumoniae的临床和环境菌株作为研究对象,比较分析染色体tRNA/tmRNA基因位点的外源DNA片段的整合情况,发现新基因组岛,进行初步功能研究。同时,完成了筛选出的泛耐药临床菌株HS11286的全基因组测序和比较分析。这将有助于理解细菌遗传多样性、致病和耐药性机理及水平转移机制,以期能够为发展新一代预防性和治疗性方法提供思路。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-8
符号说明  8-12
第一章绪论  12-25
  1.1 肺炎克雷伯菌简介  12-15
    1.1.1 肺炎克雷伯菌流行现状  12
    1.1.2 肺炎克雷伯菌耐药现状  12-14
    1.1.3 肺炎克雷伯菌致病因子  14-15
  1.2 微生物基因组学  15-18
    1.2.1 DNA 测序技术  15-16
    1.2.2 微生物基因组学  16-17
    1.2.3 比较基因组学  17-18
  1.3 可移动基因组简介  18-23
    1.3.1 基因组岛的进化  19-21
    1.3.2 基因组岛的识别  21-22
    1.3.3 基因组岛的定向克隆  22-23
  1.4 本研究的主要工作  23-25
第二章材料和方法  25-36
  2.1 实验材料  25-28
    2.1.1 菌株和质粒  25-26
    2.1.2 培养基和化学试剂  26-27
    2.1.3 酶及主要试剂  27-28
  2.2 实验方法  28-36
    2.2.1 菌种培养及保藏  28
    2.2.2 DNA 的提取  28-29
    2.2.3 DNA 的操作  29-31
    2.2.4 常规PCR 扩增  31-32
    2.2.5 tRIP-PCR 考察基因组岛的分布  32
    2.2.6 酵母醋酸锂转化  32-33
    2.2.7 递缩PCR 验证酵母转化子  33
    2.2.8 荧光实时定量PCR  33
    2.2.9 蛋白预表达  33-34
    2.2.10 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳  34-35
    2.2.11 基因组测序及生物信息学分析  35-36
第三章肺炎克雷伯菌基因组岛的定向重组  36-46
  3.1 肺炎克雷伯菌tRNA 基因位点基因组岛的筛查  36-39
    3.1.1 肺炎克雷伯菌外源基因组岛插入热点的识别  36-38
    3.1.2 肺炎克雷伯菌基因组岛的tRIP-PCR 筛查  38-39
  3.2 肺炎克雷伯菌tRNA 基因位点基因组岛的定向重组  39-44
    3.2.1 肺炎克雷伯菌tRNA 基因位点酵母捕捉载体的构建  39-42
    3.2.2 肺炎克雷伯菌tmRNA 基因位点基因组岛的定向克隆  42-44
  3.3 肺炎克雷伯菌tmRNA 基因位点基因组岛的测序及注释  44-45
  3.4 小结与展望  45-46
第四章肺炎克雷伯菌基因组岛的初步功能分析  46-59
  4.1 w49 菌株中tmRNA 基因位点基因组岛的初步功能分析  46-49
    4.1.1 基因组岛tmGI_Kpw49 的序列分析  46-47
    4.1.2 基因组岛tmGI_Kpw49 的功能分析  47-49
  4.2 HS04035 中tm RNA 基因位点基因组岛的初步功能分析  49-54
    4.2.1 基因组岛tmGI_Kp35 的比较分析  49-52
    4.2.2 基因组岛tmGI_Kp35 的环出鉴定  52-53
    4.2.3 P2-like 噬菌体的功能分析  53-54
  4.3 肺炎克雷伯菌tmRNA 基因位点岛缺失突变株的构建  54-57
    4.3.1 自杀性质粒的构建  54-55
    4.3.2 tmRNA 基因位点基因组岛缺失突变株的构建  55-57
  4.4 小结与展望  57-59
第五章肺炎克雷伯菌HS11286 的全基因组测序  59-75
  5.1 肺炎克雷伯菌HS11286 全基因组的拼装  59
  5.2 肺炎克雷伯菌HS11286 全基因组的注释及分析  59-63
    5.2.1 复制起始位点的预测  59-60
    5.2.2 基因组的注释及COG 分类  60-63
  5.3 肺炎克雷伯菌的比较基因组分析  63-72
    5.3.1 HS11286 基因组染色体的比较分析  63-69
    5.3.2 HS11286 质粒的比较分析  69-72
  5.4 小结与展望  72-75
第六章总结  75-76
附录  76-84
参考文献  84-94
致谢  94-95
攻读硕士学位期间发表的论文  95-97

肺炎克雷伯菌可移动基因组的研究

内容摘要

全文目录

相似论文