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ABCA1胞外第一环缺失突变体构建及其抗砷性研究

作　者: 张晓菲
导　师: 杨磊；黄瑾
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 抗砷基因 ABCA1基因 pcDNA3.1/ABCA1质粒 载体 突变
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：本课题运用改进的重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extension,SOE)分别构建缺失ABCA1蛋白胞外第一环第323-579,535-625位氨基酸密码子的基因,真核表达后激光共聚焦显微镜观察突变体表达情况。同时进行细胞砷耐受性实验,并观察细胞内砷含量变化及凋亡率检测,从而确定突变体是否具有抗砷功能。方法：应用重叠区扩增基因拼接法的原理,在拼接延伸后,再进行一次PCR扩增,得到ABCA1缺失第323-579,第535-625位氨基酸密码子的两条基因,克隆至pcDNA3.1/V5-His真核表达载体。在Lipofectamine2000的介导下将突变体真核表达载体转染入Hela细胞,激光共聚焦显微镜检测转染后突变体的表达。通过噻唑篮(MTT)检测48h急性砷染毒后光密度值(OD)计算生存率及半数抑制浓度(IC50),分析细胞抗砷性变化。然后运用原子荧光光度法(AFS)检测细胞内砷蓄积量的变化。同时利用annexin-V/P I双染流式细胞术检测突变体对Hela细胞凋亡的影响并与完整ABCA1及空载体比较分析。结果：成功构建缺失ABCA1蛋白胞外第一环第323-579位,将其命名为胞外-A；缺失第535-625位将其命名为胞外-B。氨基酸密码子的基因。通过激光共聚焦显微镜对pcDNA3.1/ABCA1Δ323-579AA, pcDNA3.1/ABCA1Δ535-625AA基因表达蛋白的细胞定位情况进行了分析。以pcDNA3.1/ABCA1质粒为对照结果显示：实验组与对照组结合鼠抗IgG/DyLight488后受激发光激发发出绿色荧光,均分布在细胞膜。因此认为突变后基因表达基本没有发生改变,可能定位在细胞膜上,可以进行下一步研究。Hela细胞转染胞外-A、胞外-B、野生pcDNA3.1/ABCA1质粒组、pcDNA载体组后给予不同浓度砷剂孵育48小时后用MTT法测OD值计算生存率及IC50。结果显示野生组细胞在各浓度下生存率均高于同步突变组和空载体组,随机区组方差分析各浓度下野生组与胞外-A、胞外-B、及空载体组生存率差异有统计学意义(P<0.05)；突变组与空载体组无统计学意义(P>0.05)。胞外-A、胞夕(?)-B、pcDNA载体组空载体组和野生组IC50分别为18.31μmol/l,18.26μmol/l,18.52μmol/l和29.4μmol/l。原子荧光光度法结果显示,实验组在10小时内细胞内砷的蓄积量均低于对照组,annexin-V/P I双染流式细胞术检测结果表明,NaAsO2作用24h后实验组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率,与野生对照组相比,调亡细胞所占比例显著增加(p<0.05)。结论：ABCA1蛋白胞外第一环缺失突变后基本丧失抗砷功能,可能与ABCA1抗砷功能有重要关系。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-10
英文缩略语表  10-11
前言  11-14
第一部分 材料与方法  14-30
  1 材料  14-18
    1.1 细胞株  14
    1.2 主要试剂  14-15
    1.3 主要仪器设备  15-16
    1.4 常用试剂配置  16-17
    1.5 PCR引物  17-18
  2 方法  18-30
    2.1 重组质粒、空质粒扩增及质粒抽提  18-19
    2.2 pcDNA3.1/V5-His/ABCA1重组质粒酶切  19-20
    2.3 PCR扩增目的片段  20-23
    2.4 TA克隆  23
    2.5 目的基因亚克隆  23-25
    2.6 Hela细胞株的培养保存  25-26
    2.7 脂质体转染  26
    2.8 激光共聚焦检测突变体表达  26-27
    2.9 MTT法检测细胞株的抗砷性  27-28
    2.10 AFS法检测细胞内砷蓄积量  28
    2.11 Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit检测细胞凋亡  28-30
第二部分 实验结果  30-38
  1. 突变体构建结果  30-33
    1.1 抽提pcDNA3.1/ABCA1重组质粒结果  30
    1.2 AfeI+SnaBI双酶切结果  30-31
    1.3 PCR扩增编码突变基因结果  31
    1.4 TA克隆质粒的构建和鉴定  31-32
    1.5 突变克隆质粒的构建和鉴定  32
    1.6 测序与序列分析  32-33
  2. 突变体细胞定位检测结果  33-34
  3. 突变体抗砷功能检测结果  34-38
    3.1 MTT法检测细胞抗砷性变化  34-35
    3.2 转染后细胞内砷蓄积量测定  35-36
    3.3 转染后细胞凋亡率测定  36-38
第三部分 实验讨论  38-43
小结与展望  43-44
参考文献  44-49
文献综述  49-54
  参考文献  52-54
致谢  54-55
作者简介  55-56
导师评语  56

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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