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猪繁殖与呼吸综合征病毒新型ELISA试剂盒的研制

作　者: 邵磊
导　师: 朴范泽
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ΔGp5基因 M基因 N基因酶联免疫吸附试验
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)被认定为猪的最重要传染性疾病之一,以妊娠母猪的繁殖障碍以及仔猪和成长猪的呼吸困难为主要特征。自1987年在北美首次发现该病后,PRRS已遍布世界各地。PRRSV最主要的结构蛋白是核衣壳蛋白N、膜基质蛋白M和糖蛋白Gp5。诊断PRRS的最常用的血清学方法是免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)、免疫荧光抗体试验(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。ELISA方法以其方便快捷、特异性和敏感性高以及操作方法简单、结果易于判定等优点成为检测PRRSV最常用的方法。本研究依据GenBank上公布的PRRSV北美株VR2332株序列设计10条引物用于扩增Gp5、M和N基因,去除Gp5基因N端信号肽和一个跨膜区。以PRRSV细胞培养液为模板,通过RT-PCR和重组PCR(Overlap extension assay)方法扩增串联基因ΔGp5/M/N、ΔGp5/M、ΔGp5/N和M/N基因,克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)pLysS,筛选阳性克隆,经1mmol/L的IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western Blotting方法检查表达的重组串联蛋白。分别以纯化后的各串联蛋白和N蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法,对比检测方法的敏感性和特异性,将敏感性最强的ELISA检测方法研制成试剂盒。结果,经RT-PCR扩增的ΔGp5基因片段长为330bp,M基因片段长为525bp,N基因片段长为372bp。经重组PCR扩增的ΔGp5/M串联基因片段长为855bp,ΔGp5/N串联基因片段长为702bp,M/N串联基因片段长为897bp,ΔGp5/M/N串联基因片段长为1 227bp。各重组串联蛋白经SDS-PAGE分析,在大肠杆菌中均以包涵体的形式表达。Western Blotting检测,各重组串联蛋白均可与PRRSV阳性血清抗体结合,表明表达的各重组串联蛋白均具有良好的反应原性。用建立的间接ELISA检测方法检测以繁殖障碍为主的猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)、猪细小病毒(Porcine Parvovirus, PPV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)、猪口蹄疫病毒(Porcine Foot and Mouth disease Virus, FMDV)、猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus 2, PCV2)等五种病毒,均未发现交叉反应,表明特异性良好。对比建立的5种间接ELISA检测方法,敏感性由大到小依次是ΔGp5/M/N-97.3%、ΔGp5/N-94.7%、M/N-93.3%、N-92%、ΔGp5/M-89.3%,与预期相符。将ΔGp5/M/N为包被抗原建立的间接ELISA方法研制成试剂盒,其ELISA条件优化结果为:最佳抗原包被液为CBS(pH9.6),抗原包被浓度为4μg/mL,包被时间为4℃过夜;最佳封闭液为5%DM-PBST,封闭条件为37℃4h;最佳血清稀释液为2.5%DM-PBST,血清稀释度为1:200,温育条件为37℃2h;最佳酶标二抗稀释液为5%DM-PBST,最佳酶标二抗稀释度为1:20 000,温育条件为37℃4h;最佳底物作用时间为15min;临界值为0.268。试剂盒保存期试验结果为:快诊板的最适保存温度为-20℃,保存期为30周; PBST洗液选择25×,室温或4℃保存皆可;酶标二抗的保存期为-20℃30周时与新配制的酶标二抗无明显区别;底物Buffer A灭菌后与Solution B保存于4℃。本研究成功的构建了原核表达载体pET-ΔGp5/M/N,以该重组蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA检测方法,并进行了试剂盒的初步组装。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章引言  8-13
  1.1 病毒的起源与分类  8
  1.2 病毒分子生物学特征  8-11
  1.3 血清学检测方法  11
  1.4 疫苗  11-12
  1.5 研究的目的及意义  12-13
第二章材料与方法  13-21
  2.1 材料  13-14
  2.2 方法  14-21
第三章结果  21-53
  3.1 PCR 扩增结果  21
  3.2 测序结果与同源性分析  21-22
  3.3 原核表达重组质粒的构建  22-23
  3.4 原核表达重组蛋白SDS-PAGE 结果  23-25
  3.5 重组蛋白 Western Blotting 分析  25
  3.6 PRRSV-ΔGp5/M/N ELISA 检测试剂盒的研制  25-31
  3.7 对照组ELISA 检测方法的建立  31-51
  3.8 不同间接ELISA 检测方法敏感性比较结果  51
  3.9 Western Blotting 检测临床血清  51-53
第四章讨论  53-55
第五章结论  55-56
参考文献  56-62
致谢  62-63
附录一  63-67
附录二  67-70
个人简历  70

猪繁殖与呼吸综合征病毒新型ELISA试剂盒的研制

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