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葡萄原花青素对乙醇诱发小鼠肝细胞损伤的抑制作用研究

作　者: 李静
导　师: 钟进义
学　校: 青岛大学
专　业: 卫生毒理学
关键词: 小鼠 葡萄原花青素 肝细胞 增殖活性 凋亡
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：本研究采用体外实验和动物实验的方法,通过观察葡萄原花青素(Grape Procvanidins, GPC)对乙醇诱发小鼠肝细胞增殖活性损伤,肝细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax异常表达,血清谷丙转氨酶(ALT)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肝组织GSH含量改变,以及肝脏组织病理切片改变的影响,探讨葡萄原花青素对乙醇诱发小鼠肝细胞损伤的抑制作用。方法：1体外实验：将正常新鲜小鼠肝脏组织制成肝细胞悬液,接种于96孔板上,每孔100ul,实验分为5组,分别为正常对照组、乙醇对照组和低、中、高剂量GPC组,其中乙醇对照组和各剂量GPC组分别加入终浓度为100ml/L的无水乙醇,同时低、中、高剂量GPC组分别加入终浓度分别为10、50、100mg/LGPC溶液,正常对照组只给予等量的生理盐水,每组设3个平行样,置于37℃、5%CO2培养箱培养16h,每孔加入5g/LMTT溶液20ul,继续培养4h,每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 100ul,20min,酶标仪492nm处检测各孔吸光度值(A值)。2体内实验：将50只18-20g的健康昆明种小鼠随机分为五组,分别为正常对照组,乙醇对照组和低、中、高剂量GPC组,每组10只,雌雄各5只,每天分别给予乙醇对照组和GPC各剂量组经口灌胃50%乙醇12ml/kg.bw,低、中、高剂量GPC组在给予乙醇的同时分别给予GPC 50mg/kg. bw,100mg/kg. bw和200mg/kg.bw,正常对照组只给等量蒸馏水,每天灌胃1次,持续4周。其余时间各组动物自由进食和饮水。实验结束时用无菌止血钳眼球取血,颈椎脱臼处死动物,在无菌条件下剖腹取肝脏备检。用MTT法测定各组肝细胞增殖活性水平；用免疫组织化学方法检测各组肝细胞半胱天冬酶(Caspase-3)、Bax蛋白表达；摘取眼球取血,分离血清,用ElISA法检测血清中TNF-α水平,用全自动生化分析仪测定血清中ALT水平；用分光光度计检测肝组织GSH含量；用苏木精-伊红(HE)染色光镜下观察肝组织切片病理学改变。结果：1体外实验结果：体外细胞培养MTT结果显示,乙醇对照组的肝细胞增殖活性为0.304±0.075,较正常对照组0.436±0.025降低(P<0.05)。高剂量组的肝细胞增殖活性为0.412±0.025,较乙醇对照组升高,差异具有显著性意义(P<0.05)。2体内实验结果：(1)肝细胞增殖活性：MTT结果显示,乙醇对照组肝细胞增殖活性为0.296±0.012,低于正常对照组0.398±0.009,差别具有显著性意义(P<0.05)。高、中剂量GPC组的肝细胞增殖活性分别为0.356±0.009和0.336±0.020,均高于乙醇对照组,差异具有显著性意义(P<0.05)。(2)肝细胞凋亡相关蛋白：正常对照组和高、中剂量GPC组Caspase-3阳性表达率分别为5.90%,19.08%、39.96%,均低于乙醇对照组51.78%,且差异具有统计学意义(P＜0.05)。高、中剂量GPC组和乙醇对照组Bax阳性表达率分别为14.06%、34.44%、58.08%,差异具有显著性意义(P<0.05)。(2)血清TNF-α水平：乙醇对照组TNF-α浓度为12.89±1.06(pg/ml),较正常对照组和高、中GPC剂量组均显著性升高(P<0.05)；正常对照组与GPC高剂量组之间差异无显著性意义(P>0.05)。(3)血清ALT水平：高、中剂量GPC组血清ALT含量分别为26.00±1.00(U/L)、29.00±4.58(U/L),均较乙醇对照组(39.33±3.21)降低,差异有显著性意义(P<0.05)。(4)肝组织GSH含量：乙醇对照组GSH含量为1.21±0.11,较正常对照组降低(P<0.05)；高、中剂量GPC组较乙醇对照组升高(P<0.05)；低剂量组与乙醇对照组之间差异没有统计学意义(P＞0.05)；高、中、低剂量GPC之间差异均具有显著性意义(P<0.05)(5)肝脏组织病理学改变：在HE染色镜下观察中,乙醇对照组小鼠肝细胞边界不清,肝细胞条索排列紊乱,肝细胞明显肿胀,胞质疏松,有气球样变,光镜下可见炎症细胞浸润,尤以汇管区明显。高剂量GPC组肝组织仍可见少量炎细胞浸润,但较乙醇对照组变性程度减轻结论：综合本研究结果表明,一定剂量GPC可以抑制乙醇诱发的肝细胞损伤。

全文目录


摘要  2-4
ABSTRACT  4-7
引言  7-8
材料与方法  8-15
  1 实验材料  8-9
  2 方法  9-15
    2.1 体外实验方法  9-10
      2.1.1 体外实验分组与方法  9
      2.1.2 体外实验检测指标  9-10
    2.2 体内实验方法  10-15
      2.2.1 体外实验分组与处理  10
      2.2.2 体内检测指标  10-15
结果  15-22
  1 体外实验结果  15-16
  2 动物实验结果  16-22
    2.1 肝细胞增殖活性结果  16-17
    2.2 肝细胞内Caspase-3蛋白表达结果  17
    2.3 肝细胞内Bax蛋白表达结果  17-19
    2.4 血清TNF-α含量  19-20
    2.5 血清ALT含量  20-21
    2.6 肝组织GSH含量  21
    2.7 肝组织病理学变化  21-22
讨论  22-25
结论  25-26
参考文献  26-30
综述  30-38
  参考文献  35-38
攻读硕士期间研究成果  38-39
致谢  39-40

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