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人大肠癌细胞转移相关的蛋白质组分析与鉴定

作　者: 赵亮
导　师: 丁彦青
学　校: 第一军医大学
专　业: 病理学
关键词: 蛋白质组双向凝胶电泳质谱分子标记大肠癌转移热休克蛋白27
分类号: R735.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

恶性肿瘤细胞的转移是导致患者死亡的主要原因，但迄今为止，对肿瘤转移机制的研究尚未获得突破性进展。筛选和鉴定在肿瘤转移中起重要作用的关键分子，寻找早期诊断的生物标志物和抗肿瘤转移的药物靶点，阐明肿瘤转移机制，是当前肿瘤转移的研究热点。肿瘤转移是一个多步骤、多基因参与的复杂过程，肿瘤转移的全过程受以下几个因素的调控：1、在转移启动初期E-cadherin、Ig超家族、选择素、整合素等参与肿瘤细胞间的脱落以及肿瘤细胞与胞外基质的粘附；2、肿瘤细胞或间质细胞分泌的蛋白水解酶及其抑制剂，在降解胞外基质和血管的基底膜过程中发挥重要作用；3、在运动因子、生长因子、归巢因子等的作用下，肿瘤细胞迁移到转移靶器官；4、血管增生因子VEGF、bFGF、IL-8、PDGF等促进新生血管的形成，伴随着肿瘤细胞的增生，形成新的转移灶，完成转移过程。鉴于目前对肿瘤转移机制的研究往往针对单个或少数几个分子以及关注基因水平的改变，缺乏系统性和综合性的分析，因此在所有这些调控因素中，究竟哪些分子在肿瘤转移中发挥关键作用，仍有待阐明。近年来开展的蛋白质组学技术为揭示肿瘤转移机制带来了新的希望。本研究以人大肠癌高、低转移细胞株为研究对象，采用比较蛋白质组技术鉴定了11个与大肠癌转移相关的候选蛋白，并探讨了HSP27在大肠癌转移中的作用及其功能，具体研究结果如下：1、人大肠癌细胞系蛋白质双向凝胶电泳技术的建立及其优化优化人结肠癌Lovo细胞系的蛋白质样品制备方法，建立人结肠癌Lovo细胞系的双向凝胶电泳(2-DE)图谱，为识别鉴定结肠癌发生发展相关蛋白质奠定基础。分别用磷酸盐缓冲液和等渗蔗糖溶液冲洗细胞，胰酶消化或直接刮刀法收集细胞后提取总蛋白质，利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术进行分离，凝胶经银染显色后，用PDQuest软件分析2-DE图谱。结果以等渗蔗糖缓冲液冲洗细胞并直接刮刀法所提取Lovo细胞总蛋白质进行双向电泳，可获得分辨率高、重复性好的人结肠癌Lovo细胞系2-DE图谱。等渗蔗糖溶液有效的降低了盐离子对等电聚焦的影响，聚焦效果优于磷酸盐缓冲溶液处理组；皿上直接刮刀收集的方法避免引入胰酶及其对细胞的破坏，保证了细胞蛋白质的完整性和代表性。我们实验表明以等渗蔗糖溶液冲洗细胞结合皿上直接裂解是一种较好的细胞蛋白质双向电泳样品制备方法，在此基础上我们初步建立了分辨率较高且重复性好的人结肠癌Lovo细胞系蛋白质双向凝胶电泳图谱。2、人大肠癌细胞株SW480和SW620的蛋白质组双向凝胶电泳分析为了更好的理解大肠癌转移机理和寻找大肠癌预后的标志分子，我们运用双向凝胶电泳技术对人大肠癌高、低转移细胞株SW480和SW620细胞进行了差异表达双向凝胶电泳分析，数字化图像分析发现有72个蛋白质斑点在两组凝胶中有显著差异表达，在SW620细胞中表达量升高的蛋白质斑点有30个，在SW480细胞中表达量升高的蛋白质斑点有42个；定性差异表达分析(表达量相差10倍以上)发现22个蛋白质斑点仅在SW620中出现，而有27个蛋白质斑点只在SW480中检测到，结合软件分析和手工筛选，选取15个点清晰且表达水平改变明显的蛋白质点作为质谱鉴定的靶点。3、双向凝胶电泳差异表达蛋白质的质谱鉴定和验证以大肠癌高、低转移细胞株为研究对象，采用2-DE分离技术结合MALDI-TOF质谱鉴定了11个与大肠癌转移相关的蛋白，其中SW620细胞株表达上调的蛋白质有磷酸甘油酸变位酶1，磷脂酰乙醇胺结合蛋白和高迁移率族蛋白B-1，而热休克蛋白27，膜联蛋白Ⅰ，甲硫腺苷磷酸化酶，切丝蛋白1和表皮型脂肪酸结合蛋白在SW620中表达下调。大多数差异蛋白功能涉及肿瘤细胞生长、运动、粘附、凋亡等过程，研究结果为阐明大肠癌转移机制及寻找预测大肠癌转移的潜在标志物提供了理论依据。为保证蛋白质组技术鉴定结果的可靠性，在蛋白和mRNA水平对候选蛋白进行了进一步验证。采用western blot和免疫细胞化学技术在蛋白质水平验证结果表明HSP27和COF1在低转移的SW480中高表达，且COF1仅在SW480中检测到，蛋白质水平的验证结果与比较蛋白质组的分析结果完全一致。此外，采用半定量RT-PCR技术对编码候选蛋白的mRNA水平检测结果表明：编码HMGB1和PBP的mRNA在高转移的SW620中高表达，而编码HSP27、ANXⅠ、COF1和E-FABP的mRNA在SW480中高表达，所验证的编码候选蛋白的mRNA水平验证结果与候选蛋白的蛋白质组分析结果一致，说明候选蛋白在大肠癌细胞株中的蛋白水平变化主要是由于基因的转录水平高低不同所致，也肯定了候选蛋白在高、低转移株间的差异表达。结果表明通过蛋白质组技术筛选到的转移相关蛋白是可靠的。4、热休克蛋白27与大肠癌转移的相关性分析为更好的理解大肠癌细胞的转移机理和寻找可能的肿瘤预后标记分子标志物，我们用蛋白质组学方法对两种不同转移潜能的SW620和SW480细胞株的差异表达蛋白进行了研究，发现热休克蛋白27在高转移潜能大肠癌细胞中的低表达。免疫细胞化学进一步验证和分析了该蛋白在SW620和SW480两种细胞中的差异表达和定位。68例临床大肠癌组织标本的免疫组织化学研究发现热休克蛋白27的表达率与年龄、性别、组织学分级、淋巴结转移和临床分期无相关性(x~2 test，p＞0.05)，但其过表达和大肠癌转移显著负相关(Fisher’s exact test，p=0.035＜0.05)。结果表明，大肠癌细胞热休克蛋白27的过表达和肿瘤细胞的转移行为相关，可能在阻止其转移中发挥重要的作用。综上所述，本研究应用比较蛋白质组技术对人大肠癌SW620和SW480两种不同转移潜能细胞株进行了对比研究，获得了11个差异表达蛋白质并对HSP27进行了初步验证。分析结果证实大肠癌细胞热休克蛋白27的过表达和肿瘤细胞的转移行为相关，在阻止大肠癌转移中发挥重要的作用，可能是阻止大肠癌转移的关键分子之一，研究结果将为抗大肠癌转移研究和药物的筛选提供有用的研究信息和药物分子靶标。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-16
前言  16-20
第一章人大肠癌细胞系蛋白质双向凝胶电泳技术的建立及其优化  20-36
  1 材料与方法  20-28
    1.1 材料  20-24
    1.2 方法  24-28
  2 结果  28-33
    2.1 改良Bradford法测量蛋白浓度  28-30
    2.2 不同样品制备方法2-DE比较  30-31
    2.3 不同样品处理方法2-DE图谱斑点检测比较  31-32
    2.4 不同样品制备方法凝胶图像蛋白质分离效果比较  32-33
  3 讨论  33-36
第二章人大肠癌高低转移潜能细胞株SW480和SW620的蛋白质组双向凝胶电泳分析  36-54
  1 材料和方法  36-38
    1.1 化学试剂  36
    1.2 细胞培养与蛋白质样品制备  36-37
    1.3 双向电泳  37
    1.4 凝胶染色  37
    1.5 凝胶成像及图像分析  37-38
  2 结果  38-51
    2.1 SW620和SW480细胞银染2-DE图谱  38-40
    2.2 SW620和SW480细胞蛋白质考染2-DE图谱  40
    2.3 人大肠癌高低转移潜能细胞系2-DE图谱的差异分析  40-45
    2.4 SW620和SW480细胞蛋白质组的表达变化  45-51
  3 讨论  51-54
第三章双向凝胶电泳差异表达蛋白质的质谱鉴定和验证  54-72
  1 材料与方法  54-58
    1.1 化学试剂  54-55
    1.2 胶内酶切及质谱鉴定  55
    1.3 MALDI-TOF-MS分析  55
    1.4 数据库搜索  55
    1.5 编码差异候选蛋白的mRNA在高低转移株间的半定量RT-PCR分析  55-56
    1.6 蛋白质印迹(western blot)检测  56-57
    1.7 免疫细胞化学检测  57-58
  2 结果  58-66
    2.1 差异表达蛋白质的PMF鉴定  58-64
    2.2 编码候选蛋白mRNA差异表达水平的半定量RT-PCR验证  64-65
    2.3 高、低转移株间差异候选蛋白在蛋白水平的表达差异验证  65-66
  3 讨论  66-72
第四章热休克蛋白27与大肠癌转移的相关性分析  72-82
  1 材料与方法  72-73
    1.1 病例资料  72
    1.2 试剂  72-73
    1.3 免疫组织化学检测  73
    1.4 染色结果判断  73
    1.5 统计学方法  73
  2 结果  73-78
    2.1 HSP27在大肠癌组织中的表达情况  73-74
    2.2 HSP27表达和临床病理特征的关系  74-76
    2.3 特殊病例分析  76-78
  3 讨论  78-82
全文小结  82-84
参考文献  84-96
附录一  96-98
附录二  98-108
攻读硕士学位期间成果  108-110
致谢  110-112

人大肠癌细胞转移相关的蛋白质组分析与鉴定

内容摘要

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