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三尖杉、罗汉松和珙桐内生真菌鉴定及遗传多样性研究

作　者: 叶静
导　师: 王嘉福；冉雪琴
学　校: 贵州大学
专　业: 微生物学
关键词: 三尖杉罗汉松珙桐内生真菌遗传多样性 ITS RFLP
分类号: S718.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

三尖杉、罗汉松和珙桐均属于热带或亚热带植物,三尖杉和罗汉松为裸子植物,珙桐属被子植物,均为国家保护植物,由于3种植物都有良好的药用价值。近年来被大量的砍伐,野生种质资源破坏严重。为了科学地保护这些种质资源,本文以三尖杉、罗汉松和珙桐根、茎、叶、果等不同组织中分离的274株内生真菌为实验材料,根据菌落的颜色、质地、生长速率和分生孢子外观等形态学特征,对这些菌株进行了形态学鉴定。274株内生真菌中,75株内生真菌在人工培养基上不产孢子,经菌落形态对比分析表明其中的22株疑似拟茎点霉属,经诱导实验成功产孢2株,鉴定为拟茎点霉属(Phomopsis)。221株内生真菌鉴定为子囊菌亚门(Ascomycotina)和半知菌亚门(Deuteromycotina)2个亚门的4纲,5目,10属,其余53株不产孢内生真菌待鉴定。采用特异性PCR对所有菌株的核糖体转录间隔区(ITS,Internal transcribedspacer)片段进行扩增,获得600bp左右的单带,以4种限制性内切酶(HinfⅠ,HhaⅠ,MspⅠ,PstⅠ)对扩增的ITS片段进行限制性酶切片段长度多态性RFLP(Restriction fragment length polymorphsim)分析,结果显示出丰富的RFLP多态性,对三种植株的内生真菌酶切图进行聚类分析,三尖杉内生真菌RFLP有42个带型,罗汉松内生真菌为40个带型,珙桐内生真菌的酶切带型为36个。根据RFLP分析和形态学鉴定结果,从3种植物内生真菌中选取相似水平低、形态差异大的18株内生真菌进行了ITS碱基序列测定,最终确定274株内生真菌属于2个亚门,4纲,6目,11属,一个待定菌株和无孢菌群。与形态学鉴定结果大体相符。这些研究结果表明三尖杉、罗汉松和珙桐内生真菌的属和种丰富,表现为热带真菌类型,优势属为刺盘孢属、曲霉属、小丛壳属;其中的小丛壳属是首次从三尖杉科植物中分离。本文的研究结果提示三尖杉、罗汉松和珙桐内生真菌有丰富的遗传多样性,构成复杂的微生态系统,为后续研究奠定基础。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-8
一、前言  8-22
  1 植物内生真菌简述  8-11
    1.1 植物内生真菌的定义  8
    1.2 植物内生真菌与宿主的关系  8-9
    1.3 内生真菌的专一性  9-10
    1.4 内生真菌的起源  10-11
  2 植物内生真菌的多样性  11-15
    2.1 植物内生真菌物种多样性  11-12
    2.2 植物内生真菌的生态多样性  12-14
    2.3 植物内生真菌遗传多样性  14-15
  3 实验相关植物  15-17
    3.1 罗汉松(Podocarpaceae)  15-16
    3.2 三尖杉(Cephalotaxus)  16-17
    3.3 珙桐(Davidia involucrate Baill.)  17
  4.分子生物学技术在内生真菌研究中的应用  17-22
    4.1 分子生物学技术的引入  17-19
    4.2 真菌分类鉴定、种群遗传结构等研究的分子分子生物学技术  19-21
    4.3 应用分子生物学技术在内生真菌研究中的新发现  21-22
二、论文研究目的及意义  22-23
  1 研究目的  22
  2 研究意义  22-23
三、实验的技术路线  23-25
四、材料与方法  25-39
  1 实验材料及试剂  25-26
    1.1 实验材料  25-26
    1.2 培养真菌试剂  26
    1.3 限制性内切酶多样性分析(RFLP)及真菌种属鉴定试剂  26
  2 培养基  26-27
  3 试剂  27-30
  4 实验仪器  30-31
  5 实验方法  31-39
    5.1 内生真菌的培养  31
    5.2 内生真菌形态学鉴定方法  31-32
    5.3 内生真菌的保种  32
    5.4 内生真菌总DNA的提取及检测  32-33
    5.5 内生真菌ITS基因片段的扩增  33-35
    5.6 ITS扩增片段的限制性酶切分析  35
    5.7 内生真菌多样性及其聚类分析  35
    5.8 部分内生真菌分子生物学鉴定  35-38
    5.9 内生真菌的分子鉴定及系统发生关系分析  38-39
五、结果  39-56
  1 内生真菌的形态学鉴定  39-43
    1.1 三尖杉内生真菌菌株形态学鉴定  39-40
    1.2 罗汉松内生真菌菌株形态学鉴定  40-42
    1.3 珙桐内生真菌菌株形态学鉴定  42-43
  2 内生真菌rDNA ITS区间的RFLP分析  43-49
    2.1 内生真菌基因组提取及rDNA ITS区间的PCR扩增  43-44
    2.2 内生真菌rDNAITS区间RFLP酶切  44-46
    2.3 内生真菌rDNA ITS区间酶切结果聚类分析  46-49
  3 部分菌株ITS的克隆测序  49-51
  4 部分菌株ITS核苷酸序列测定与分析  51-56
六、讨论  56-60
七、小结  60-61
致谢  61-62
参考文献  62-69
附录  69-74

三尖杉、罗汉松和珙桐内生真菌鉴定及遗传多样性研究

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