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猪繁殖与呼吸综合征病毒PPO3部分生物学性状稳定性研究及ELISA诊断方法的建立

作　者: 王保山
导　师: 熊焰
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 生物学性状的稳定性 ELISA 病毒蛋白
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本研究对实验室分离保存的猪繁殖与呼吸综合征病毒PPO3的理化特性和毒力性状的稳定性进行了测试。将PPO3病毒在-75℃下保存3年后,再经传代弱化,后续试验结果显示:该毒株在56℃下感作30min可被迅速灭活;氯仿等有机溶剂可迅速破环其囊膜结构;BUDR不影响病毒的有效增殖与复制;其在Marc-145细胞上形成以细胞圆缩、葡萄状聚集和大面积脱落为特征的细胞病变（接毒量为0.5mL/瓶）,这与3年前陈杰的试验结果基本一致。病毒在pH6.0～7.2时,毒力稳定,但随着传代次数的增多,该毒株对酸性环境（pH＜5.5）的耐受性逐渐增强,细胞病变产生时间由原来的5天缩短为3-4天。通过对PPO3传代55代次,提取病毒的表面蛋白,经SDS-PAGE得到46.1KD、40KD、37.5KD、17.5KD和15.7KD的5条主要抗原蛋白条带,与原PPO3毒株的主要抗原蛋白基本一致。表明PPO3病毒表面蛋白稳定。此外,通过对ORF6保守基因序列分析,设计合成了1对引物,并筛选出了最佳反应条件:95℃预变性5 min;95℃30s,56℃30s,72℃35s,进行35个循环,最后72℃延伸10min,成功获得了分子量为350 bp的特异性目的片段;而同时对HCV、PRV、PPV及Marc-145细胞进行同条件检测,结果均为阴性,从而进一步证实了PPO3为一株猪繁殖与呼吸综合征病毒。传代试验结果显示,PPO3病毒在Marc-145细胞上连续传代55代次后,其TCID50为10-4..56/0.1mL,比原毒株(TCID50为10-3.6/0.1mL)对MARC-145细胞的感染性增强（P＜0.05）,差异显著。但抗体中和试验结果发现,经55代次的连续传代后,PPO3病毒对于抗体的中和效价有所增高,其抗体中和效价为1/7,而原PPO3毒株（保存3年的）的抗体中和效价为1/37,差异显著（P＜0.05）。本研究经纯化病毒,制作病毒抗原和高免血清（标准毒株制备）,建立了间接ELISA诊断检测方法。经正交试验,最终确定抗原的最佳稀释度为1:40,抗体的最佳稀释度为1:5,阳性标准OD值为0.362,阴性值为0.019,空白对照值为0.004,标准SP值为0.4,并建立了PPO3 ELISA检测的标准曲线。通过对20个临床样品的检测,其中样品阳性血清检出率为80%,阴性检出率为20%,基本符合该猪场的实际情况。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
缩略词表  7-10
1.文献综述  10-23
  1.1 猪繁殖与呼吸综合征的研究历史及现状  10-11
  1.2.PRRS的流行病学及免疫学  11-12
  1.3 PRRS的病原学  12-20
    1.3.1 PRRSV基本特征  12-13
    1.3.2 PRRSV的分类  13
    1.3.3 PRRSV的抗原性  13-14
    1.3.4 抗体依赖性增强作用  14-15
    1.3.5 PRRSV的细胞增殖特性  15-16
    1.3.6 PRRSV持续感染  16
    1.3.7 PRRSV的致病机理  16-18
    1.3.8 PRRSV的抗原性变异  18-19
    1.3.9 PRRSV的毒力变异  19-20
  1.4 分子生物学  20-21
  1.5 PRRSV的抗原蛋白研究  21-23
2.目的和意义  23-24
3.材料与方法  24-32
  3.1 试验材料  24-26
    3.1.1 毒株  24
    3.1.2 细胞及细胞培养液  24
    3.1.3 主要仪器设备和实验器材  24-25
    3.1.4 主要试剂药品  25-26
  3.2 试验方法  26-32
    3.2.1 病毒的复苏培养  26-27
    3.2.2 病毒的分子生物学鉴定  27-28
    3.2.3 病毒的理化试验  28
    3.2.4 毒力试验和中和试验  28-30
    3.2.5 蛋白电泳(SDS-PAGE)  30
    3.2.6 ELISA诊断方法的建立  30-32
4.试验结果  32-43
  4.1 病毒的复苏与培养  32
  4.2 RT—PCR扩增结果  32-33
    4.2.1 特异性  32-33
    4.2.2 敏感性  33
  4.3 病毒理化指标  33-34
    4.3.1 耐热性试验  33-34
    4.3.2 脂溶剂敏感性试验  34
    4.3.3 耐酸性试验  34
  4.4 毒力试验和中和试验  34-37
    4.4.1 病毒的传代弱化  34
    4.4.2 毒力试验结果  34-36
    4.4.3 中和试验结果  36-37
  4.5 蛋白电泳(SDS-PAGE)  37-39
  4.6 血清学试验  39-43
    4.6.1 反应板均一性测定  39
    4.6.2 抗原、抗体最佳稀释度的确定  39-40
    4.6.3 阳性、阴性OD值的计算  40-42
    4.6.4 待检样品的检测结果  42-43
5.讨论  43-47
  5.1 病毒的复苏与培养  43
  5.2 RT-PCR扩增结果及特异性  43-44
  5.3 病毒的理化试验  44-45
  5.4 PPO3毒力变异分析  45-46
  5.5 SDS-PAGE  46-47
  5.6 PPO3的血清学试验  47
6.结论  47-49
参考文献  49-54
致谢  54

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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