学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

重组ChIFN-γ基因的表达及油菜的遗传转化

作　者: 许文钊
导　师: 吴拥军
学　校: 贵州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 鸡γ-干扰素原核表达基因构建遗传转化
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 14次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目前,每年全世界鸡肉消费量约占全部肉制品消费总量的40%,为提供健康的鸡肉,每年要耗费几十亿美元用于饲养和防疫。γ-干扰素具有广谱抗病毒活性和免疫保护作用,在生产上有实际的应用意义。应用植物生物反应器生产IFN蛋白具有天然活性,生产成本低,可以直接口服,避免了后期繁琐的纯化。缺乏重组ChIFN-γ蛋白及抗ChIFN-γ蛋白的多克隆或单克隆抗体等基础研究试剂,是转ChIFN-γ基因植株蛋白检测分析滞后的主要原因。因此,本研究将ChIFN-γ基因克隆至表达载体pET32a中,并转化E.coli BL21中,1m mol/L IPTG 37℃诱导表达12h ChlFN-y表达量达到菌体总蛋白的37%。SDS-PAGE电泳检测表明,ChIFN-γ重组蛋白分子量约为33kDa,计算出ChIFN-γ蛋白分子量为16kDa。本研究为下一步的抗体制备及转基因油菜蛋白检测奠定了基础。目前本实验室已经建立了比较成熟的油菜农杆菌介导法遗传转化体系。本研究采用种子特异性启动子及相关信号肽,以Genbank数据库鸡干扰素序列为对象,依据油菜密码子偏嗜性人工合成基因,构建pSW-Napin-ChIFN-γ-NOS植物表达载体。采用农杆菌介导法将ChIFN-γ基因(载体为pSW)遗传转化油菜下胚轴、子叶柄。经Kan筛选,获得抗性植株62株。经PCR鉴定,获得5株转化Napin-ChIFN-γ-NOS基因植株。Southern blot检测出2株有杂交信号,均为单拷贝,表明ChIFN-γ基因已整合进了转基因油菜植株基因组中。ELISA定量检测转基因植株ChIFN-γ蛋白,结果表明转基因植株ChIFN-γ蛋白表达量最高达到1 120pg／g鲜重。本研究为通过口服喂养转ChIFN-γ基因植株提高鸡体免疫应答能力,达到提高禽病防治效果奠定了基础,为建立干扰素新的生产模型和禽病防治提供实验依据及手段。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-8
前言  8-19
  1.1 干扰素的研究进展  8-11
    1.1.1 干扰素的生物活性  8-9
    1.1.2 IFN-γ的研究进展  9-10
    1.1.3 干扰素的应用研究  10-11
  1.2 目的基因转化方法  11-14
    1.2.1 农杆菌介导转化法  11-12
    1.2.2 基因枪法  12
    1.2.3 激光微束穿刺转化法  12-13
    1.2.4 其他转化方法  13-14
  1.3 植物生物反应器  14-18
    1.3.1 植物生物反应器的研究进展  14-15
    1.3.2 转基因植物作为生物反应器存在问题与解决方法  15-18
  1.4 目的及意义  18-19
实验部分  19-55
  1. 油菜偏嗜性ChIFN-γ合成及原核表达  19-32
    1.1 材料与方法  19-20
      1.1.1 菌种与质粒  19
      1.1.2 工具酶和试剂  19-20
      1.1.3 主要仪器  20
    1.2 基因的设计与合成  20-27
      1.2.1 基因的设计  20
      1.2.2 质粒pBSK-ChIFN-γ的提取  20-21
      1.2.3 PCR扩增目的基因ChIFN-γ  21
      1.2.4 PCR产物的胶回收  21-22
      1.2.5 ChIFN-γ基因的克隆  22-24
      1.2.6 表达载体的构建  24-25
      1.2.7 诱导表达  25-27
    1.3 结果与分析  27-31
      1.3.1 基因的设计  27
      1.3.2 ChIFN-γ基因的扩增  27-28
      1.3.3 ChIFN-γ基因的克隆  28
      1.3.4 表达载体的构建  28-29
      1.3.5 ChIFN-γ在大肠杆菌中的表达  29-31
    1.4 讨论  31-32
  2 植物表达载体pSW-Napin-ChIFN-γ-NOS的构建及遗传转化油菜的研究  32-44
    2.1 实验材料与试剂  32-35
      2.1.1 实验材料  32
      2.1.2 主要试剂  32-35
    2.2 实验方法  35-39
      2.2.1 真核表达载体pSW及质粒pBSK-NGN的提取  35
      2.2.2 PCR扩增目的基因Napin-ChIFN-γ-NOS  35
      2.2.3 PCR产物和真核表达载体pSW的酶切及胶回收  35-36
      2.2.4 胶回收片段的连接及转化大肠杆菌TG1感受态细胞  36
      2.2.5 植物表达载体pSW-Napin-ChIFN-γ-NOS转化农杆菌EHA105  36-37
      2.2.6 无菌材料的准备  37
      2.2.7 农杆菌介导油菜遗传转化  37-39
    2.3 结果与分析  39-43
      2.3.1 表达载体pSW-Napin-ChIFN-γ-NOS的构建  39-42
      2.3.2 pSW-Napin-ChIFN-γ-NOS遗传转化油菜  42-43
    2.4 讨论  43-44
  3 抗性植株的分子鉴定  44-55
    3.1 实验试剂  44-45
      3.1.1 植物基因组提取试剂  44
      3.1.2 PCR检测试剂  44
      3.1.3 Southern blot试剂  44-45
      3.1.4 GUS染色试剂  45
      3.1.5 转基因植株ChIFN-γ蛋白检测试剂  45
    3.2 实验方法  45-50
      3.2.1 油菜基因组的提取  45-46
      3.2.2 抗性植株的PCR鉴定  46-47
      3.2.3 油菜基因组的酶切  47-48
      3.2.4 Southern blot检测  48-49
      3.2.5 GUS活性检测  49
      3.2.6 油菜总蛋白的提取  49
      3.2.7 ELISA定量检测转基因植株ChIFN-γ蛋白  49
      3.2.8 转基因油菜表型观察  49-50
    3.3 结果与分析  50-54
      3.3.1 PCR检测抗性植株  50
      3.3.2 转基因油菜基因组的southern杂交检测  50-51
      3.3.3 转基因植株的GUS活性检测  51-52
      3.3.4 ELISA定量检测转基因植株ChIFN-γ蛋白  52-53
      3.3.5 转基因植株的表型观察  53-54
    3.4 讨论  54-55
展望  55-56
参考文献  56-63
缩略词表  63-65
致谢  65-66
附录  66-67

重组ChIFN-γ基因的表达及油菜的遗传转化

内容摘要

全文目录

相似论文