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唾液腺腺样囊性癌XT-Ⅰ与XT-Ⅱ基因共沉默的实验研究

作　者: 包刚
导　师: 王洁
学　校: 河北医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 唾液腺腺样囊性癌 蛋白多糖 木糖基转移酶 共沉默 RAN干扰 腺病毒 裸鼠 凋亡
分类号: R739.87
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


目的:唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一，侵袭性强，可转移，易复发，预后不佳，迄今尚无较理想的治疗措施。SACC中的肿瘤性肌上皮细胞（neoplastic myoepithelial cells, NMCs）可以分泌蛋白多糖（proteoglycans, PGs），构成肿瘤的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）。在SACC中，过多的ECM逐渐堆积，形成囊腔样结构，从而呈现出SACC特有的组织学特点。富含PGs的ECM，构成了SACC细胞的大分子微环境（macromolecules microenvironment）。SACC细胞在这一微环境内生存，继而进展，出现增殖、分化、侵袭、转移、复发等一系列生物学行为。目前认为，PGs是SACC的形态学表现和生物学行为必不可少的物质基础，参与肿瘤的发生和发展过程。人木糖基转移酶（xylosyltransferase, XT）是人体PGs生物合成的起始酶和限速酶，催化此合成过程的效率—限制阶段（rate-limited step），它的活性真实反映PGs的生物合成率。人XT有两个亚型（isoform）：XT-I和XT-II，催化作用几乎相同，但是在人体不同细胞的表达有所差异。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是目前最有效的基因沉默（genesilencing）技术，可以特异、高效地阻断特定基因的表达。腺病毒载体是将外源基因导入细胞内的常用媒介，同时表达一个以上目的基因的腺病毒载体，可同时发挥多个基因的功能，提高了腺病毒载体的利用率。本研究拟构建一个同时沉默XT-I和XT-II基因的质粒载体，即编码2条shRNA的干扰质粒，腺病毒包装，获得重组腺病毒rAd5-shRNA-WJ7＋WJ4；通过感染SACC-83细胞，干扰XT-I和XT-II的表达，阻抑PGs合成，检测其沉默效果；建立SACC-83的裸鼠移植瘤模型，瘤体内注射重组腺病毒，观察其对移植瘤凋亡的影响。旨在探讨SACC中XT-I和XT-II对PGs的调控作用，以及XT-I和XT-II共沉默对细胞凋亡的影响，并为唾液腺肌上皮性肿瘤的生物治疗提供更多的依据。方法：1构建分别靶向抑制人XT-I基因和人XT-II基因的两个重组质粒设计靶向抑制人XT-I基因的shRNA-WJ4和靶向抑制人XT-II基因的shRNA-WJ7的干扰位点和引物序列，合成shRNA-WJ4和shRNA-WJ7的单链目的基因片段，分别与质粒pGenesil-1.2和pGenesil-1.1的线性化载体连接，扩增质粒，酶切鉴定，确定获得重组质粒pGenesil-1.2-shRNA-WJ4和pGenesil-1.1-shRNA-WJ7。2构建同时靶向抑制人XT-I基因和人XT-II基因的共沉默质粒双酶切以上两个重组质粒，回收大小片段，WJ7大片段与WJ4小片段的连接，扩增质粒，酶切鉴定，测序验证共沉默质粒shRNA-WJ7＋WJ4。3重组腺病毒质粒的制备从质粒pGenesil上通过LR体外同源重组将shRNA-WJ7＋WJ4表达框转移至pGSadeno腺病毒表达载体上，扩增质粒，酶切鉴定。4包装共沉默重组腺病毒制备线性化腺病毒DNA，连接重组腺病毒质粒片段，转染HEK293细胞，放大培养共沉默重组腺病毒rAd5-shRNA-WJ7＋WJ4。5构建阴性对照重组腺病毒rAd5-shRNA-HK6重组腺病毒感染细胞培养SACC-83细胞，分3组：SACC-83-WJ7＋WJ4组（沉默组）、SACC-83-HK组（空载体组）、SACC-83组（未感染组），确定最佳MOI值为100，细胞感染48h的荧光最强，计算感染率。7检测感染48h后3组细胞XT-I和XT-I mRNA的表达TRIzol法提取细胞总RNA，测定RNA纯度、浓度、完整性，逆转录合成cDNA第一链，实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）检测3组细胞XT-I和XT-I mRNA的相对表达量，计算沉默率。8检测感染48h后3组细胞培养液中PGs的含量用标准品建立浓度-吸光度标准曲线，生物染色法测定PGs含量，计算抑制率。9裸鼠移植瘤模型的建立及分组4周龄雌性BALB/c-nu裸小鼠32只，14～15g，无特定病原体（specificpathogen-free, SPF）条件饲养，每只于左侧背部接种SACC-83细胞2.5×106个／250μl；62d后，选取瘤体最长径在1cm以上的24只，随机数字表法分为3组：SACC-83-WJ7＋WJ4组（沉默组）、SACC-83-HK组（空载体组）、SACC-83组（未感染组），每组8只。10重组腺病毒裸鼠移植瘤内注射接种肿瘤细胞后62d，首次瘤内注射重组腺病毒，SACC-83-WJ7＋WJ4组（沉默组）注射共沉默腺病毒rAd5-shRNA-WJ7＋WJ4，SACC-83-HK组（空载体组）注射阴性对照腺病毒rAd5-shRNA-HK，SACC-83组（未感染组）注射PBS，每只4×109PFU／200μl，每周注射一次，共5次。11标本采集3组裸鼠首次注射腺病毒5周后断颈处死，分离移植瘤，测量体积，新鲜瘤组织立即分切为4份，1份80C冻存，3份用于以下实验。12流式细胞术样品制备和凋亡检测70%乙醇固定标本，剪碎法＋网搓法制备单细胞悬液，PI染色，流式细胞术检测3组样品的细胞凋亡情况。13HE染色样品制备和观察10%福尔马林固定标本、石蜡包埋、切片、HE染色、光学显微镜观察3组标本的形态学变化。14透射电镜超薄切片样品制备和观察标本分切至小于1mm3，4%戊二醛前固定、1%锇酸后固定、环氧树脂包埋、超薄切片、醋酸铀和柠檬酸铅双重染色30min、透射电镜观察细胞凋亡情况。结果：1分别靶向XT-I、XT-II和阴性对照的siRNA序列设计结果shRNA-WJ4CAGGCAGCCCATCAAACCTshRNA-WJ7CGTCTCCTCAAGGCCGTTTATshRNA-HK GACTTCATAAGGCGCATGC2酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定结果、测序验证结果均证明质粒正确。3重组腺病毒感染SACC-83细胞的效率重组腺病毒感染后48h，以表达绿色荧光的细胞作为成功感染的细胞，SACC-83-WJ7＋WJ4组（沉默组）与SACC-83-HK组（空载体组）的感染率分别为98.7%和99.1%。4Real-Time PCR检测XT-I和XT-II的沉默效果感染后48h，SACC-83-WJ7＋WJ4组（沉默组）XT-I和XT-II的mRNA相对表达量明显低于SACC-83-HK组（空载体组）与SACC-83组（未感染组），SACC-83-HK组与SACC-83组之间无差别。SACC-83-WJ7＋WJ4组XT-I和XT-II的沉默率分别为97.3%和88.0%。5XT-I和XT-II基因共沉默对SACC-83细胞PGs合成分泌的影响感染后48h，SACC-83-WJ7＋WJ4组（沉默组）细胞培养液中PGs含量明显低于SACC-83-HK组（空载体组）和SACC-83组（未感染组），抑制率为68.61%，SACC-83-HK组PGs未受到抑制。6裸鼠移植瘤最终体积首次注射腺病毒后5周，3组裸鼠移植瘤体积无统计学差异。7流式细胞术测定裸鼠移植瘤细胞凋亡率首次注射腺病毒后5周，3组裸鼠移植瘤细胞凋亡率无统计学差异。8光学显微镜观察裸鼠移植瘤形态学变化首次注射腺病毒后5周，光镜观察裸鼠移植瘤HE染色石蜡切片，3组间未见明显的形态学差异，均未观察到显著的细胞凋亡现象。9透射电镜观察裸鼠移植瘤细胞凋亡现象首次注射腺病毒后5周，SACC-83-WJ7＋WJ4组（沉默组）易见细胞凋亡现象，其余两组较少。结论：1重组腺病毒rAd5-shRNA-WJ7＋WJ4能够有效诱导SACC-83细胞XT-I和XT-II基因沉默，并阻抑PGs合成分泌。2裸鼠SACC-83移植瘤内注射沉默XT-I和XT-II基因5周，沉默组出现细胞凋亡，但无统计学意义。

全文目录


摘要  5-9
ABSTRACT  9-15
英文缩写  15-17
引言  17-19
第一部分 同时靶向抑制人 XT-Ⅰ 和 XT-Ⅱ 的 shRNA 重组腺病毒的构建  19-49
  前言  19-20
  材料与方法  20-36
  结果  36-38
  附图  38-42
  附表  42-43
  讨论  43-45
  小结  45-46
  参考文献  46-49
第二部分 腺样囊性癌细胞 XT-Ⅰ 和 XT-Ⅱ 基因共沉默及沉默效果测定  49-77
  前言  49-50
  材料与方法  50-61
  结果  61-63
  附图  63-68
  附表  68-70
  讨论  70-73
  小结  73-74
  参考文献  74-77
第三部分 裸鼠腺样囊性癌移植瘤 XT-Ⅰ 和 XT-Ⅱ 基因共沉默与凋亡的关系  77-106
  前言  77-78
  材料与方法  78-89
  结果  89-90
  附图  90-101
  讨论  101-103
  小结  103-104
  参考文献  104-106
结论  106-107
综述 木糖基转移酶与蛋白多糖相关疾病  107-123
  参考文献  116-123
致谢  123-124
个人简历  124

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 口腔、颌面部肿瘤 > 唾液腺肿瘤
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