学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

作　者: 张昊
导　师: 邱广斌
学　校: 吉林大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: MYCT-1基因 慢病毒载体 胃肿瘤
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 23次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


胃癌是发病率最高的恶性肿瘤之一。胃癌发生的确切分子机制尚不清楚，临床诊治尚无特别有效的办法。因此，研究在其发生过程中起作用的关键基因，对胃癌的早期诊断和有效防治具有极其重要的作用。MYCT-1(myc target-1)基因定位于6q25，曾命名MTLC(myc target from laryngealcarcinoma cells)[11]。主要分布于细胞核，在各种正常组织中均有表达，而在胃癌、喉癌、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤表达下调，因此它可能是一个新的抑癌基因[12-15]。研究表明MYCT-1是c-Myc细胞信号传导途径中的一个重要成员，在该细胞信号传导途径中处于独特的位置，以转录因子的形式参与细胞正常生理活动的调控。对胃癌中MYCT-1基因表达的研究发现，MYCT-1基因在76%的胃癌组织中表达下调，且表达水平在正常组织、癌组织和转移癌组织中依次降低。基因转染实验表明MYCT-1基因过表达可抑制胃癌BGC823细胞生长，促进细胞凋亡。说明MYCT-1基因表达降低在胃癌发生、发展过程中起重要作用。利用RNA干涉技术将胃粘膜GES-1细胞中MYCT-1基因沉默，发现MYCT-1表达降低虽然不能直接导致正常胃粘膜细胞恶性转化，但引起胃癌细胞增殖减慢，凋亡增加，细胞周期S期延长，提示MYCT-1基因的功能可能是抑制细胞DNA合成。在本研究中，我们将MYCT-1基因与酶切后的慢病毒载体进行定向连接，构建携带有MYCT-1基因的重组慢病毒表达载体，并通过转染293T细胞对其进行包装，以获得可供后续实验转染用的滴度，为后续的动物实验及进一步研究该基因在肿瘤治疗及发生中的作用创造条件。目的构建携带MYCT-1基因的重组慢病毒载体GV218-MYCT-1，为进一步研究及动物实验奠定基础。方法MYCT-1基因片段经PCR扩增后，与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接，获得GV218-MYCT-1重组慢病毒并转化细菌感受态细胞。阳性克隆菌落行PCR鉴定，对重组质粒进行测序并转染入293T细胞，荧光显微镜下观察GFP表达并行Western blot鉴定。将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装，Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果1. GV218-MYCT-1过表达质粒慢病毒的阳性克隆鉴定结果将目的基因片段行PCR扩增后交换入线性化表达载体，阳性转化子PCR产物大小为912bp，阴性转化子PCR产物大小为198bp。阳性克隆测序结果与目标序列比对完全一致。2. GV218-MYCT-1重组质粒293T细胞蛋白表达结果将GV218-MYCT-1重组质粒转染293T细胞后，细胞内可观察到明显的荧光，转染表达结果较强，说明目的质粒转染正常、目的质粒荧光标记基因表达正常。经Western Blot检测，可以观察到52KD附近处有特征条带，其大小和目的基因融合蛋白相吻合。3. GV218-MYCT-1慢病毒包装及滴度检测结果将编码慢病毒颗粒的重组GV218-MYCT-1质粒及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞，48小时后对慢病毒进行收获及浓缩，并行Real time定量PCR测得病毒滴度为2×10~8TU/ml。结论将MYCT-1基因与酶切后的慢病毒载体GV218进行定向连接，可构建出含有MYCT-1基因编码序列的重组慢病毒载体GV218-MYCT-1。将其转染293T细胞并进行Western Blot检测蛋白，结果显示目的基因MYCT-1可成功表达。再通过三质粒共转染293T细胞包装慢病毒，经浓缩及收获，可获得滴度为2×10~8TU/ml的重组慢病毒，为后续动物实验转染及进一步研究该基因在肿瘤治疗及发生中的作用奠定了良好的基础。

全文目录


前言  4-5
摘要  5-8
Abstract  8-14
第1章 绪论  14-17
第2章 材料与方法  17-24
  2.1 实验材料  17-18
  2.2 实验方法及观察指标  18-24
第3章 结果  24-29
  3.1 MYCT-1 PCR 扩增产物凝胶电泳结果  24
  3.2 GV218-MYCT-1 过表达质粒慢病毒的阳性克隆鉴定  24-27
  3.3 GV218-MYCT-1 重组质粒 293T 细胞蛋白表达  27-28
  3.4 RT 定量 PCR 法检测滴度  28-29
第4章 讨论  29-32
  4.1 MYCT-1 基因的生物学特性分析  29
  4.2 慢病毒载体的功能及优势  29-31
  4.3 构建MYCT-1慢病毒载体  31-32
第5章 结论  32-33
参考文献  33-37
作者简介及在学期间所取得的科研成果  37-38
致谢  38

相似论文

  1. 普洱茶抑制乳腺癌SHZ-88细胞及保护亚基胍诱导的胃癌前病变和放疗损伤的作用,R285.5
  2. 利用慢病毒载体制备转基因小鼠和牛胚胎的研究,S814.8
  3. 慢病毒载体介导的RNAi特异性沉默猪Myostatin基因的研究,S828
  4. 重组EGFP慢病毒载体示踪转染的脐带间充质干细胞联合β-磷酸三钙移植治疗免股骨头缺损性坏死的研究,R681.8
  5. 胰岛素强化治疗对胃癌根治术患者静息能量消耗的影响,R735.2
  6. 慢病毒载体介导人LIGHT基因对裸鼠大肠癌移植瘤抑制作用的研究,R735.34
  7. 脂肪间充质干细胞PD-L1基因沉默对大鼠肝移植急性排斥反应的影响,R657.3
  8. 抑制Ppif基因的表达减轻大鼠肾缺血再灌注损伤,R363
  9. 胃癌组织中S100A4和VEGF-C表达与淋巴结转移和预后的关系,R735.2
  10. 胃癌术中不同淋巴结清扫术疗效及安全性比较的系统评价,R735.2
  11. 稳定转染HBV X基因对人胆管癌细胞系RBE生物学行为的影响,R512.62
  12. 专利蓝脂质体的制备及其淋巴标记的实验研究,R735.2
  13. 功能性稳定表达Cre重组酶的vero-Cre细胞系的构建,R346
  14. 以GFP为报告基因的多基因共表达慢病毒载体系统的构建,R346
  15. 胃癌术前分期与术后病理对照临床分析,R735.2
  16. 重组SV40大T抗原慢病毒表达载体的构建,R346
  17. 慢病毒介导的人碱性纤维生长因子基因的构建及在鼠骨髓间充质干细胞中表达的实验研究,R346
  18. Survivin shRNA慢病毒载体构建,R733.3
  19. IL-15慢病毒表达载体的构建及体外实验,R730.2
  20. HIV-1整合酶的四肽156KELK159在慢病毒载体基因整合过程中的作用研究,R346
  21. APP695-siRNA慢病毒载体构建及其对SH-SY5Y细胞中APP695基因表达的作用,R346

中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
© 2012 www.xueweilunwen.com