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MicroRNA-10b在NPM1突变急性髓系白血病细胞分化阻滞中的作用探讨

作　者: 谭诗
导　师: 张伶
学　校: 重庆医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 急性髓系白血病 NPM1突变分化 THP-1细胞系 miR-10b KLF4 急性白血病细胞分化 NPMc+AML
分类号: R733.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

第一部分探讨NPM1基因突变对急性白血病细胞分化的影响核仁磷酸蛋白基因（nucleophosmin，NPM1）突变在急性髓系白血病的发生发展中发挥至关重要的调控作用，而与白血病分化阻滞的关系尚未阐明。为探讨NPM1突变基因对白血病细胞体外分化的影响，将携带NPM1A型突变（NPM1-mA）的表达质粒载体pEGFPC1-NPM1-mA转染THP-1细胞系，构建稳定表达NPM1突变蛋白的细胞株（THP-1mA），同时设立野生型NPM1转染组（THP-1wt）、空载体转染组（THP-1C1）及未处理组（THP-1）为对照。通过RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学验证THP-1mA细胞株的构建。利用PMA诱导各组细胞分化，瑞氏-吉姆萨染色观察细胞分化的形态改变，计算贴壁细胞率；流式细胞术分析细胞表面分化抗原CD14的表达。结果显示，成功构建稳定表达NPM1突变蛋白的THP-1mA细胞株。PMA作用72h后，与对照组相比，THP-1mA组细胞的分化形态学改变不显著，贴壁细胞数明显降低（P<0.05）；同时，CD14的表达受到显著抑制（P<0.01）。提示NPM1突变能够阻滞白血病细胞系的体外分化。第二部分MicroRNA-10b通过调控锌指蛋白KLF4阻滞白血病细胞分化探讨microRNA-10b（miR-10b）通过抑制锌指蛋白Krüppel-likefactor4（KLF4）的表达对急性白血病细胞分化的影响。双荧光素酶报告基因试验及Western blot验证KLF4为has-miR-10b的功能靶基因之一；qPCR及Western blot分别检测不同分化程度的白血病细胞系中miR-10b与KLF4的表达；1,25-二羟基维生素D3（1,25D3）诱导人白血病细胞系HL60向单核系分化，检测此过程中miR-10b及KLF4的表达变化；利用体外合成的寡核苷酸（has-miR-10b mimics）转染HL60细胞，瑞氏-吉姆萨染色观察1,25D3诱导后细胞分化形态学的改变，流式细胞术检测单核细胞表面标志CD14的表达。结果显示，KLF4为has-miR-10b的功能靶基因；miR-10b在分化早期的KG-1a细胞中表达最高，在分化较晚期的U937、THP-1细胞中表达最低（P<0.01），而KLF4的表达与之相反；经1,25D3诱导HL60向单核系分化过程中，miR-10b的表达呈时间依赖性降低，KLF4则逐渐增高；HL60细胞中过表达miR-10b后可抑制1,25D3诱导的细胞分化形态学的改变及CD14的表达（P<0.05）。提示miR-10b通过负调控KLF4的表达阻滞白血病细胞HL60向单核系分化。第三部分MicroRNA-10b参与阻滞NPM1突变的白血病细胞分化NPM1突变可引起骨髓增生的异常，然而AML的发生还须合并其他损伤因素。miRNA调控作为重要的表观遗传学调控之一，在白血病发生中发挥重要作用。为进一步探讨miR-10b失调是否参与调控NPMc+AML细胞分化，qPCR及Western blot分别检测THP-1mA及OCI/AML3细胞中miR-10b与KLF4的表达；利用体外合成的反义寡核苷酸（has-miR-10b inhibitor）转染OCI/AML3细胞，检测KLF4蛋白的表达，流式细胞术检测单核细胞表面标志CD14的表达情况。结果表明，THP-1mA细胞中miR-10b表达明显增高（P<0.05），同时KLF4蛋白表达水平下降；在携带有NPM1A型突变的白血病细胞系OCI/AML3中miR-10b的表达显著高于其他单核系白血病细胞（P<0.01），而KLF4的蛋白水平降低；抑制OCI/AML3中miR-10b后，KLF4蛋白水平增高，CD14阳性细胞数明显增多（P<0.05）。miR-10b异常表达并参与调控NPMc+AML细胞的分化阻滞。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
前言  14-17
第一部分探讨 NPM1 基因突变对急性白血病细胞分化的影响  17-33
  1 材料与方法  17-28
  2 结果  28-31
  3 讨论  31-33
第二部分 MicroRNA-10b 通过调控锌指蛋白 KLF4 阻滞白血病细胞分化  33-47
  1 材料与方法  33-39
  2 结果  39-45
  3 讨论  45-47
第三部分 MicroRNA-10b 参与阻滞 NPM1 突变的白血病细胞分化  47-52
  1 材料与方法  47-48
  2 结果  48-50
  3 讨论  50-52
全文总结  52-53
参考文献  53-56
文献综述  56-65
  参考文献  61-65
致谢  65-66
攻读硕士学位期间发表的学术论文  66-67

MicroRNA-10b在NPM1突变急性髓系白血病细胞分化阻滞中的作用探讨

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